定量检测方法学性能验证的系统设计
复旦大学附属华山医院检验医学中心 毕波 吕元【摘要】定量检测项目在正式用于患者标本检测前或检测系统有重大改动后，需对厂商提供的或引用专业文献的相关方法学分析性能予以证实，需证实的方法学性能包括准确度、精密度、灵敏度、特异性、可报告范围、参考区间等。不同检测项目和不同的检测系统需选择证实的分析性能实验各不相同，每种方法学验证实验进行的先后顺序亦有所不同，实验室需对进行的方法学验证实验进行合理选择、系统设计。
【关键词】诊断技术和方法；评价研究
根据美国《临床实验室改进法案修正案》(Clinical Labomtory Improvement Amendment 88，CLIA’88)规定，2003年美国病理家学会(couege of American Pathologists，CAP)要求参加认可的实验室，在开展某一检测项目前，需提供并保留相关的方法学验证实验数据，即某一检测项目在正式用来检测患者标本、发出检验报告前，实验室需对其相关方法学分析性能予以验证，对厂商提供的评价资料中的主要性能予以确认。此外，对于一些已知检测项目若检测系统有重大改变，如更换检测方法、同一检测方法但更换不同型号的仪器、更换同一型号的仪器、仪器重要部件更换、定标品或试剂品牌更换等，亦需对改变后的检测系统的分析性能做详细充分的评价，只有通过验证实验，证实检测系统的基本分析性能符合临床要求，或者与厂商或文献提供的资料一致，才可以将检测系统用于常规工作。
需进行的方法学验证实验包括：准确度验证实验、精密度验证实验、灵敏度验证实验、分析特异性验证实验、可报告范围验证实验、参考区间验证实验、最大稀释度验证实验、标本携带污染验证实验等。如何合理选择、系统设计某一检测项目的方法学验证实验方案非常重要。
一、合理选择方法学验证实验
(一)不同检测系统应选择不同的方法学验证实验
1．对于使用厂商提供的原检测系统(即封闭系统)进行检测的检验项目，即使用相应配套试剂、配套校准品，严格按照厂商提供的各种参数设计和操作规程操作，由于厂商能够提供详细性能资料，实验室在使用这样的检测系统作患者标本检测前，只需做基本性能验证实验，即精密度验证实验、可报告范围验证实验、准确度验证实验和参考区间验证实验，个别低值特别有诊断价值的检测项目需做功能灵敏度验证实验。其他方法学性能可以引用厂商提供的资料。
2．实验室根据实际工作情况，需对厂商提供的原检测系统进行调整或改动，即使用开放系统或封闭系统的开放通道，如调换不同试剂厂产品或不同型号产品；未使用配套的校准品；操作程序作相应调整；仪器设置的参数调整，如样品用量减小、试剂用量变化、反应时间缩短或计算方式变动等。以上任何一种改变，实验室需对改变的检测系统的分析性能作详细充分的方法学性能验证实验，即除进行基本方法学性能验证外，尚需进行其他验证实验，包括灵敏度、特异性、最大稀释度、标本携带污染实验等，以确认改变后的检测系统符合临床要求，方可用于临床常规工作的开展。
(二)不同检测项目选择不同的方法学验证实验
1．对于低值特别有意义的检测项目，必需进行功能灵敏度验证实验，如促甲状腺激素(TSH)的检测等。功能灵敏度(Functional Sensitivity，FS)有别于检测低限(lower limit of detection，LLD)或生物检测限(biologic limit of detection，BLD)，它是检测系统在实验室条件下所能测得的最低检测限。功能灵敏度是以天间重复变异系数(CV)为20%时对应检测限样品具有的平均浓度，确定为检测系统或方法可定量报告分析物的最低浓度或其他量值的限值。通过对某些定量测试项目的灵敏度评价，评估该检测系统可检测最低分析物浓度，为分析测量范围和临床可报告范围的低限值确定做参考。
2．对于多点定标的检测项目无须进行分析测量范围(Analytical Measurement Range，AMR)的验证实验。AMR即定量检测项目的线性检测范围，是检测系统的重要分析性能之一，是指患者标本未经任何处理(稀释、浓缩或其他预处理)，由检验系统直接检测得到的可靠结果范围，在此范围内不同患者标本报告结果值间的比值反映各标本内含有的分析物确实有这样的比例关系。通过线性验证实验，实验室可证实检测系统的线性性能、决定其测量范围、核实校正的正确性、发现试剂的变质和检验结果的精确度等。如某检测项目为多点定标(一般为5个水平，至少包括高、中、低3个水平)，则不需要进行AMR的验证实验，此时该系统的测量范围由定标品的定值范围决定。CAP对临床开展的一些检测项目提供线性验证品，并对线性结果利用多项式回归分析方法判定线性。此外，如果厂商提供的高浓度的线性验证品不能满足临床工作上的需要，或者一些检验项目没有厂商提供的商品化的线性验证品，实验室可通过选择高浓度患者标本，将样品做不同程度稀释或配制后，将预期值和实测值作比较，确定该方法的分析测量范围。
3．对于临床可报告范围(Clinical Reportable Range，CRR)大于AMR的检测项目，需进行最大稀释度验证实验。CRR即定量检测项目向临床所能报告的结果范围，患者标本可经稀释、浓缩或其他处理，有别于AMR。CAP要求定量检测项目须进行AMR验证实验，即线性验证实验，并确定每个项目的CRR。此后每半年至少需进行一次线性验证实验，而CRR一经确定、不需更改。许多定量检测项目的CRR比AMR窄，个别高值特别有临床意义的检测项目的CRR宽于AMR，需证实该项目的最大稀释度(或浓缩度)，并结合其临床决定水平和功能灵敏度共同确定该项目的CRR。
4．对于某些测试项目CRR范围很宽泛，临床上可能出现极高检测值标本，且较小的携带污染可产生较显著临床意义，实验室需进行标本的携带污染验证实验。如绒毛膜促性腺激素、肌酸激酶等的检测。
5．应根据每个检测项目的实际情况进行参考区间验证实验。参考范围的准确与否直接影响医生的诊断和治疗，是分析性能中较为重要的指标。由于参考范围的建立是针对某一部分人群确立的，对于一些生物学变异较大的测试项目，不同人种乃至不同地区的人群，其参考范围不尽相同。CAP要求实验室通过对引用的试剂说明书、参考书或文献中的参考区间进行证实，确保提供的参考区间适合对患者诊疗的需要。
每个新的测试项目开展前或其分析方法学改变甚至患者群改变时都需进行参考区间验证实验。对于参考个体的样本较难获得的测试项目(如血中药物浓度的检测、脑脊液中总蛋白的检测等)，可直接引用厂商推荐的参考区间。使用不同仪器或方法检测同一测试项目时，应对仪器、方法学间结果是否具有可比性先作出评价，否则不同仪器或方法应各自有参考区间，分别进行参考范围的验证实验。如某一测试项目有多种样本类型，如血清、血浆、尿液标本，应分别对不同类型的样本进行参考区间的证实。
二、系统设计方法学验证实验方案
每个检测项目需进行的验证实验内容不同，种类多样，如何将需进行的方法学验证实验按照合理的顺序依次进行呢?实验室在进行方法学验证实验前应对所需进行的验证实验项目进行系统设计，形成一套合理的评价方案。
(一)先完成精密度验证实验和标本携带污染实验，检测系统的良好的重复性和无携带污染是进行其他方法学验证实验的前提，如果重复性不好或存在样本携带污染，则其他的方法学评价实验缺乏基本的保障。
(二)在确认精密度和无携带污染后，进行准确度验证实验。准确度验证实验包括以下几种形式。
1．通过方法学比对实验评估新检测系统相对于原来检测系统的检测结果的准确度；
2．对既往CAP或其他权威机构提供的室间质控品进行检测，检测结果与已知的“靶值”和可接受限进行比对；
3．通过对定值的质控品或定标品(该项目所用的定标品除外)的检测，检测结果与相关的说明书提供的“靶值”和可接受范围进行比对，并计算回收率；
4．使用配制的已知分析物浓度的样本，检测结果和配制后应得的“靶值”比较，计算回收率，回收率在90%～110%结果为可接受；
5．将样本分装后与参比实验室共同检测，比较两个实验室检测结果的一致性。
通过以上几种方式对定量测试项目进行评价，初步评估检测系统的准确度。实验室根据项目的不同选择恰当的形式的准确度验证实验，了解与原有的检测系统或公认的参考方法的测定结果间的差异。只有通过了准确度的验证，方能进行其他后续的方法学验证实验。
(三)在检测系统的精密度和准确度经过验证后，依次可进行最大稀释度验证实验、功能灵敏度验证实验、分析测量范围验证实验。
1．最大稀释度验证实验是进行功能灵敏度验证实验和分析测量范围验证实验的前提。只有通过最大稀释度验证实验，了解该检测系统对标本的最大允许稀释倍数，才能在设计功能灵敏度验证实验时，确定检测限样品的系列稀释倍数。
2．功能灵敏度验证实验是某些分析测量范围验证实验的基础。某些检测项目需选择低值、高值标本进行分析测量范围验证实验，确定某检测系统的功能灵敏度后，即可选择接近功能灵敏度的检测标本进行AMR验证实验。
(四)所有需证实的方法学性能经证实都达到要求后，最后进行参考区间的验证。参考区间验证实验在我国尤其应得到各实验室的重视。由于我国许多自动分析系统是引自欧美等国，其厂商提供的参考区间与国人的差异较大，必须对所有定量测试项目的参考区间进行证实，而不应直接沿用试剂厂商提供的来源于欧美人群的参考区间。如参考区间验证结果与提供的范围不符，则应进行参考区间确立试验，即根据文献和相关研究确定参考个体的选择原则后选择大样本参考个体进行参考区间的确立。
此外，检测系统的性能评估不单纯是方法学评估相关的工作，还涉及检验科的全程质量保证体系的多个环节，如质控品复溶是否用A级吸管，实验室定期监控的纯水质量是否达标，离心机的转速和计时器是否定期校正，冰箱温度是否监控，各种自动分析仪、温度计及移液枪等仪器是否定期校正，不同批号试剂的批间差是否监控，实验室操作人员的能力是否符合要求等等，所以建立一个完整的全程质量保证体系是检测系统性
能可靠、有效评估的前提和基础，也是目前医院检验科需要努力的方向。
总之，CAP对各实验室关于定量检测项目的方法学验证实验提出很高要求。某一定量检测项目在正式用于患者标本检测前或检测系统有重大改变后必需对检测系统的分析性能做详细充分的评价，确认检测系统符合临床要求，方可准予常规检测。国内实验室所用检测系统种类繁多，更应合理选择、系统设计定量检测项目的方法学验证实验方案。
编辑：范伟伟
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