定量检测系统分析性能—分析范围之一
冯仁丰定量检测的主要分析性能，我认为除了精密度外，分析范围（即检测范围或线性范围）应是第二个重要性能。由于临床实验室的检测习惯是对每个病人标本的每个检测项目（分析物或被测量）只做一次就发出报告，因此，同一病人标本在同一个检测系统上的检测结果，必须具有良好的重复性和再现性，以保持病人结果的稳定。但是，两个病人的检测结果数量值的比较，从医生和病人的理解上一致认为他们结果的数量值应可反映病人样品内分析物含量的比例关系。若一个病人ALT（谷氨酸氨基转换酶）的活力结果为40U/L，另一个病人ALT的活力结果为200U/L，通常医生认为这两个ALT结果差五倍。这是临床和病人对临床实验室的最低要求。其实从临床实验室自身的理解上，也会这样认识这两个结果差五倍。可是据我所知，国内大多临床实验室很少对常规使用的检测系统进行过线性的验证！这是我们临床实验室的悲剧。为了确保定量检测结果在我们报告的范围内，可以真实反映各个样品内分析物含量间的比例关系，必须重视检测系统的分析范围性能。在尚未对检测系统正确度性能进行验证前，这里的分析范围只是确认各个样品报告结果与样品内含分析物是否具有恒定比例关系。
一、几个词语的定义
1、以下各个词语的定义来自CLSI EP6-A2（2003）
（1）线性范围－检测系统结果具有可接受线性的范围；即：非线性误差小于误差的规定。
（2）线性－提供的检测结果和检测样品中分析物浓度（或其它量）呈比例的能力；注：（1）线性指的是对整个系统的响应（即：最终的分析结果，而不是初始的仪器输出）；（2）系统的线性采用检测系列已知相互关系分析物水平（也许不了解绝对准确浓度）予以确定；将所有的系统结果和这些值点在图上，实验点形成直线关系的程度为系统线性的度量。
（3）检测范围－一系列的检测量，它们的检测仪器误差在规定的限值内；注：（1）检测量值的范围，在该范围内符合方法的可接受规格；即，因非线性、不精密度、或其它来源的误差等都在规定限值内；（2）正规的词为可报告范围。
需要说明的是，在CLSI文件和美国的CLIA法规中，均使用了可报告范围来表示分析范围或检测范围。我们临床实验室却经常将可报告范围视为样品经稀释重新检测后乘以稀释倍数报告的上限，不对样品做稀释直接检测得到的报告范围称为分析范围或检测范围。
2、CAP关于分析范围等定义
（1）分析检测范围（Analytical Measurement Range，AMR）：标本未经任何稀释、浓缩、或其他预处理（不是通常检测的过程），由方法能直接检测的分析物范围。
（2）临床可报告范围（Clinically Reportable Range，CRR）：允许对标本稀释、浓缩、或其他预处理下，方法能检测的分析物范围，用于扩大分析检测范围。
（3）可报告范围的限值依据是否符合准确度和精密度要求，例如定量的最小限值或灵敏度等。在这样的情况下，临床相关限值会较预期的分析范围小，临床相关范围将用于可报告范围的限值。
分析检测范围（AMR）是标本未经稀释、浓缩、或不是通常检测过程的其他预处理，由某方法直接检测分析物值的范围。对AMR确认，即检测系统将正确地回收整个AMR分析物的浓度或活力。
二、线性的表现
1、标准曲线或线性关系表现
手工操作的检验阶段时，临床化学的操作手册（程序）中，经常以一个标准液的测定结果吸光度（即上述定义中指的初始仪器输出）为准，所有样品的检测吸光度与标准液吸光度相除，乘上标准液分析物浓度，得到检测样品内该分析物的结果。在我进入临床实验室起，几乎大多临床化学的定量检验项目均这样叙述。仔细思考这样做法的前提，是操作手册规定的报告范围应事先被验证。以系列标准液在操作方法规定的条件下进行检测，若以分析物浓度为x、吸光度为y，实验可以得到通过原点的直线（严格讲为线段）的范围内，可以认为操作手册叙述的计算结果在该范围内是正确的。当时手工操作的检测项目，需要正式绘制标准曲线、在曲线上查阅报告结果的很少。也即大家都认为临床化学绝大多数项目，它们的标准曲线都是直的。因为是通过原点（0），所以都可以直接以一个标准液为准，计算所有样品的检测结果。
何为标准曲线？为什么不称标准直线？这似乎说明大多检测项目的标准线都是弯的，所以被称为标准曲线。严格讲，分析物浓度与参与反应的显色吸光度间呈直线的很少，真的呈典型曲线表现的也不太多，大多是略有弯曲、可以近似当作直线处理的。所以临床实验室经常在口头上以“差不多”表示今天的检测结果质量。
2、判断标准曲线线性的直观做法
通过原点直线的特点是组成直线的所有点应具有相同的斜率，这是最原始、最有用的判断方式。我建议不要将估计或验证分析范围的实验数据，一开始就使用诸如美国临床和实验室标准研究院（CLSI）的批准文件：定量分析方法线性评价（EP-6A），进行繁琐的统计分析处理；尤其在不懂这样处理的含义时，更不应该去用。尽可能地采用一些直观、方便的做法很容易做出判断。以往绘制标准曲线的做法是判断标准曲线是否为直线表现的做法，很值得重提。
现在，带有计算机的自动分析仪已经普及。仪器可对反应响应呈不同表现的仪器输出结果作适当的处理后，直接以最终计量单位方式报告检验结果。在此情况下，评价病人结果检测范围时，不必再去评价响应结果的真实曲线状态，只要将样品作不同程度稀释或配制后，将预期值和实际检测值作比较，绘制在坐标纸上应呈一条通过原点、斜率为1的直线。直线所达的限值即为该方法的病人结果检测范围。其实，过去绘制标准曲线时，y轴为吸光度；现在的y轴是已经由自动化仪器转换后的实际检测计量值，从原则上它们反映的曲线状态都说明有无“直线”或“曲线”的关系。前者被称为“标准曲线”，后者被称为“分析物（被测量）的预期值与被检测值的关系”。所以，在判断有无直线关系时，求对应的每个实验点具有的y值（吸光度或被检测值），与x值（预期的分析物值）的比值（斜率），若各点的斜率几乎一样，很快就可判断这是一条通过原点的直线关系。
3、真正直线的表现
本人35年前曾经为核实美国著名学者Doumas将双缩脲总蛋白测定方法推荐为总蛋白参考方法时，按照Doumas的试剂和操作程序，对系列混合血清总蛋白稀释液检测显色后，在721分光光度计上540nm下比色测定。每个总蛋白稀释液重复测定4次，结果见表1。
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进行线性实验时，对每个标准稀释液进行多次检测以避免不精密度的影响，这里对每个样品进行了4次重复检测。从每组重复检测吸光度说明每组不精密度情况相似（有关对这样不精密度的估计以后有介绍），因此取均值表示。可以即刻绘制标准曲线，从图上判断线性，见图1。由图可知，该双缩脲方法在18~108g/L间，在540nm下的吸光度呈一条通过原点的直线。
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其实在绘制的图上难以判断稍稍有点弯的线。此时，完全可以计算每个实验点的斜率予以判断。表1中，对每个蛋白标准稀释液计算相当于每18g/L的吸光度（即斜率）行中，每个标准液的斜率范围为0.107~0.110，几乎一致。说明这条双缩脲的显色曲线确实是一条通过原点的直线，也说明使用这个方法检测病人总蛋白上限为108g/L。需要注意的是，不可将该方法的分析范围写为：0~108g/L，因为该曲线实验的起点为18g/L。实验没有验证小于18g/L的实际表现。
若以72g/L为标准液，其检测吸光度为0.435，计算所有原吸光度下的检测总蛋白量见表2。
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可以总结为：如果检测的曲线确实为直线表现的，在任何一个实验点计算的斜率在各点间几乎一样，很快就可判断这是一条通过原点的直线关系，这是非常实用的判断方式。
4、曲线表现之一
从实验室可以检测血液中含氮的成分起，只有肌酐采用了碱性苦味酸直接检测，除此之外，很长时间只报告血液总氮、蛋白氮和非蛋白氮。以后开始有了可以直接检测血液尿素的方法，但在报告结果时，还是以尿素内含氮的量表示，被称为“尿素氮”[更完整的该项目名称为“血液尿素氮（BUN）”，原先进行尿素氮检测使用的样品是全血样品，经去除蛋白成为无蛋白血滤液后再被检测的]，这是为了可以与总氮等比较了解病人在蛋白代谢上的状态。上世纪70年代出现了二乙酰一肟法检测血清尿素的方法后，该方法与以往进行非蛋白氮检测方法相比简单了许多，很快在国内被广泛采用。这个方法在国外文献上也是以单个尿素标准液为标准，通过计算得到各个样品内尿素的含量（均以尿素氮表示）。几乎没有人怀疑过它的显色曲线。为了真实了解上海检测尿素结果的质量，我在上世纪70年代进行了二乙酰一肟法检测血清尿素的标准曲线实验（当时，所有尿素的结果均以尿素氮mg/dl表示，现在使用了尿素的mmol/L。两者关系不在这里阐明。为便于说明问题，我依然使用了原尿素氮的计量单位，请读者谅解）。
尿素测定方法：硫酸镉、硫代氨基脲的二乙酰一肟直接比色法。在721分光光度计上510nm处，以试剂空白校准吸光度为零，测定各标准显色液的吸光度，结果见表2。
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以20mg/dl尿素氮为标准，显色吸光度为0.400。按照单点标准方式计算所有各个吸光度对应的尿素氮含量。
与双缩脲方法检测总蛋白的标准曲线一样，计算每个尿素标准液浓度下检测吸光度的比率（即斜率），见表3的最后一行。可以看到，随着尿素（氮）浓度的增加，检测吸光度与尿素浓度比的斜率从0.204逐渐下降为0.157。清楚说明二乙酰一肟法检测尿素的显色表现不是线性是曲线，即随着每个标准液尿素浓度升高，显色吸光度读数呈曲线状升高。因此，若以20mg/dl尿素氮为标准，低于20mg/dl的样品的结果基本上像直线关系，但在这样的浓度下，结果无临床意义；但高于20mg/dl的结果报告均偏低。样品中含有40mg/dl尿素氮的检测结果为36.5mg/dl；60mg/dl的被报告为51.5mg/dl；80mg/dl的被报告为63mg/dl。
尿素（氮）是肾功能的重要项目，将尿素（氮）报告结果偏低延误病人的治疗，后果严重。
5、显色呈双曲线表现
其实，在临床实验室中的曲线表现除了直线外，曲线可以是以二元二次方程表达的弯曲状态（如逐点下弯或逐点上升），也可以是以二元三次方程表达的双曲线状态。
40年前，本人曾经在探索使用邻甲酚酜肽络合酮（o-CPC）检测血清总钙的方法。与我合作的年轻同事很长时间不给我绘制标准曲线的实验结果。因为她认为钙在1.25~3.75mmol/L（5.0~15.0mg/dl）范围内是一条直线。可是她的实验结果表现为：绘制通过0和2.5mmol/L的直线后，在低于2.5mmol/L（10mg/dl）处，实验点均在该直线之下，超过2.5mmol/L后的实验点却都在该直线之上。如图2所示。原先文献上作者的标准曲线是直线，但这条直线从1.25mmol/L起绘制，从常理上似乎很可以理解，没有病人样品钙的结果会低于1.25mmol/L的。
经我实验证实我同事实验是对的。将1.25mmo/L、2.50mmol/L、和3.75mmol/L比色结果与它们浓度间关系，绘制在图上，这三点可以连成一条直线，但延长这条直线却不通过原点，呈负截距表现。再次阅读文献时，想起前辈陶义训老师的教导，对文献中标准曲线图上曲线趋势可通过尺去度量，评价作者的实验结果。经评价确认原作者已经发现o-CPC方法是一条不通过原点的直线，为避免对此的讨论，故意将曲线图从1.25mmol/L开始。在考虑如何建立校准方法时有同事提出，在试剂中添加少量钙标准，加入的钙含量可以从该直线与x轴相交显示的钙浓度估计出来，将负截距纠正过来。但再次实验，将钙标准配制为：0.25、0.50、0.75、1.00和1.25mmol/L各个低浓度，3.75、4.00、4.25、4.50、4.75和5.00mmol/L，再次绘制两个范围内标准曲线的具体表现。经实验确认，o-CPC方法对血清钙检测方法从0.25~5.00mmol/L钙标准溶液的显色曲线，为一条双曲线表现（见图2）。
40年前的实验说明，整个呈色有一个逐渐缓慢上升的过程，表现为向上弯曲的曲线；以后随着钙浓度呈恒定比例上升；在样品内钙浓度过高时，因试剂量不足使呈色下降，表现为向下弯曲的曲线；整个表现为双曲线。今天再次查阅其他文献，知道o-CPC与钙的络合，必须是一个o-CPC分子上络合两个钙才会呈色。当钙浓度过低时，每个o-CPC分子只能与一个钙络合，不会呈色；当钙浓度逐渐上升后，有些o-CPC分子开始出现与两个钙络合呈色。当钙浓度较高时，o-CPC试剂显得不足，呈色开始与钙浓度又不成比例，曲线下降。
对于这样的显色表现，大多自动化仪器上还是以2.5mmol/L为校准品，绘制一条通过原点的直线，查阅或计算各个样品内钙浓度。这样处理数据的方式使低于2.5mmol/L的钙检测结果具低于真实浓度；高于2.5mmol/L的钙检测结果具高于真实浓度，也即造成低血钙的样品的检测结果更低、高血钙样品的检测结果更高，这就是目前采用o-CPC方法检测钙的现状。
较好的处理方式是，使用钙浓度分别为1.25mmol/L和3.75mmol/L两个校准品，实验已经证实在1.25~3.75mmol/L内，o-CPC方法对钙检测的显色呈直线关系，但不可将这个关系延伸出去。采用插入法计算样品内钙的真实浓度，公式如下：
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（图中x轴上的1.0经换算后为样品内钙浓度为5.0mmol/L）
（图说明：图左上：这是文献上的原始曲线图，图上的结果并未减去空白读数。图右上：在空白读数处画一条横线，为扣除空白读数后的曲线。由图可看出，若绘制通过1.25mmol/L、2.5mmol/L和3.75mmol/L的直线后，出现了不通过原点的负截距。图左下：若仅绘制通过0和2.5mmol/L的直线时，可看出低于2.5mmol/L的所有曲线实验点均在直线的下侧，高于2.5mmol/L的所有曲线实验点均在直线的上侧，说明不可以2.5mmol/L单点校准。图右下：较可靠的做法是，连接1.25mmol/L[即图中第一条垂线所在位置]与3.75mmol/L[图中第三条垂线所在位置]形成直线，按上述的插入公式计算所有样品的检测结果。）
三、我的认识
1、我非常重视分析性能范围的实验
经常有实验室同道问我，一个实验室人员应该具备怎样的能力？尽管目前临床实验室已经广泛采用了自动分析仪，几乎所有操作动作均由仪器替代操作人员实施。但是，我坚持认为：一个临床实验室人员必须具有过硬的手工操作能力。一定不要忘记，我们是进行检测的人员。一个好的检测人员，他（她）应该具有扎实的专业知识、熟练阅读文献（特别是外文文献）、并具有归纳和总结同类文献中认识看法一致和不一致的能力外，还必须具有良好的动手能力。所谓动手能力包括了：手工加液的重复性、正确进行系列溶液配制和稀释、善于把握实验的关键所在、具有不认输的毅力等，最后还具有分析和总结问题的能力。遇到问题不是拍脑袋空想，而是养成一切以实验结果为依据去分析回答。这样，我们的临床实验室一定会兴旺发达！
我对学生和新同事，在开始动手做临床病人样品检测前，要求他们绘制两条标准曲线。第一条是双缩脲方法检测总蛋白的直线。我要求他们对每个总蛋白稀释标准液（均由每个人自行稀释配制）进行10次重复检测。要求每个被检测的总蛋白稀释液的吸光度读数间几乎一致（而不是如“狗牙咬的般参差不齐”的数据），并且最后每个总蛋白稀释液的斜率一致。绘制的曲线图，每组数据间因重复性所致的离散几乎也一致。经过反复实验锻炼能绘制出真正符合要求的直线。
绘制的第二条标准曲线是以往的“赖氏法”的丙氨酸氨基转换酶的标准曲线。这是一条非常典型的曲线，而且在某个指定的酶单位处有一个曲线拐点。重复性要求同上述总蛋白实验要求。经过许多次的实验练习，从开始痛苦“流泪”苦不堪言到最后对自己实验结果的内心喜悦，我知道他们可以接受病人标本检测了。因为此时他们知道了怎样做实验。
在今天的自动化面前，我相信依然可以进行这样的实验锻炼。中国临床实验室检验人员需要接受严格的实验训练。
2、必须强调对每个分析物（被测量）的检测系统进行分析范围的验证
没有对检测系统的精密度、分析范围性能的验证，直接使用检测系统对病人样品检测发出报告，这是对病人不负责任。我认为绘制标准曲线固然现在很少应用，但是，对于检测结果的正确可靠在原则上，了解检测信号或由检测信号换算得到的报告结果，与样品中原始分析物浓度间是否呈通过原点的直线关系，是确保使用单一校准品报告检测结果可靠的重要前提。可惜，今天的临床实验室真正对使用的检测系统分析范围进行过验证的很少很少。这是非常严重的问题！
本文叙述了观察曲线图（或预期值与实验值关系图）和计算斜率，了解是否具有线性的直观做法。以后我将介绍如何理解直线回归统计处理确认是否具有线性的做法。也将为大家分析现今的EP-6A文件内容、该文件的优点和不足。还有，怎样去验证检测系统的分析范围？怎样去验证检测系统的可报告范围。欢迎大家对我提出宝贵意见。
摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第八期
编辑：范伟伟
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