维生素D检测标准化进程
作者：周琰, 潘柏申单位：复旦大学附属中山医院检验科
近10年来, 越来越多的研究发现维生素D与心脏疾病、糖尿病、类风湿关节炎、多发性硬化症、帕金森氏障碍以及某些癌症之间存在着密切的联系。随着临床实验室检测维生素D的需求量日益剧增, 一些体外诊断厂商推出了许多新的全自动检测25-羟基维生素D的免疫学方法, 同时一些实验室也建立了以液相串联质谱（liquid chromatography tandem-mass spectrometry, LC-MS/MS）为代表的检测方法。但是, 随着检测的大范围开展, 临床实验室专家们发现不同检测方法间的结果明显不一致, 甚至结果的差异影响了临床对维生素D缺乏的诊断。
为了纠正这种情况, 2010年, 美国启动了维生素D标准化计划（the Vitamin D Standardization Program, VDSP）。我们介绍了国外维生素D检测标准化的相关内容以及进展情况。
一、维生素D的生化特性
维生素D是一种类固醇激素, 通过调节肠道吸收和肾脏重吸收作用维持机体的钙平衡。维生素D主要包括2种类型：维生素D2和维生素D3。维生素D3（胆钙化甾醇）主要通过人体皮下组织中7-脱氢胆固醇经紫外线B（波长295~315 nm）照射后转化合成, 因此维生素D也被称为“ 阳光维生素” 。维生素D2（麦角钙化醇）人体无法合成, 主要存在于部分植物中。
体内维生素D通过与白蛋白和维生素D结合蛋白结合后经血液运送至肝脏, 在肝脏分泌的25-羟化酶（25-hydroxylase, CYP2R1、CYP27A1）的参与下, 完成25号位的羟化过程并形成25（OH）D。在肾脏中, 25（OH）D进一步被1α -羟化酶（1 alpha-hydroxylase, CYP27B1）转化成具有生物活性的1, 25（OH）2D3（1, 25-dihydroxyvitamin D3, 又称骨化三醇）。
25（OH）D是机体维生素D的主要储存形式, 占总量的95%以上。由于其半衰期长（2 ~ 3周）, 并且不受血钙和甲状旁腺素水平的影响, 因此被公认为是客观评价维生素D营养状况的最佳指标。
二、检测技术面临的问题
由于血循环中25（OH）D与结合蛋白的紧密结合（亲和常数高达1× 10^7~1× 10^9）, 准确定量维生素D必须先将其与结合蛋白彻底分离。目前市售的免疫学方法都有各自的专利方法分离维生素D和结合蛋白。最新的检测方法甚至包含特殊阻断剂, 能够有效减少样本中嗜异性抗体对检测结果的干扰。
对于LC-MS/MS而言, 沉淀样本中的结合蛋白并使用有机溶剂萃取维生素D是检测的必须步骤。由于大部分LC-MS/MS方法不能有效区分25（OH）D和其C3差向异构体, 因此会导致检测结果假性增高。虽然3-epi-25（OH）D主要存在于儿童体内, 成年人的含量较低, 但这种假性增高的结果会误导临床对维生素D缺乏的患者进行正确的诊断和处理。
2010年, 来自临床和实验室的专家们共同推荐25（OH）D的检测方法应能同时检测出25（OH）D2和25（OH）D3, 以保证来源于植物或动物的维生素D补充均能够被检测出。因此, 临床实验室需要选择一种可以同时识别2种25（OH）D形式的检测方法。
三、维生素D检测方法间的结果差异
目前, 由于维生素D检测的标准化工作刚刚起步, 各种检测方法间存在着明显的结果差异, 尤其是商业化方法以及不同实验室的自建方法。研究发现检测结果存在差异的主要原因是检测抗体的特异性差异、解离结合蛋白的方法差异和嗜异性抗体的干扰 。
临床实验室专家们都意识到检测25（OH）D与检测血脂、糖化血红蛋白和激素的情况类似, 由于不同方法使用的不同抗体直接导致了结果的不一致。例如：同一份样本使用维生素D2抗体识别率分别为80%和100%的不同方法检测, 结果必然不同。
类固醇激素与结合蛋白的结合度非常高, 因此在免疫反应前必须被完全解离和释放。不同方法使用的解离试剂均不同, 这可能直接导致患者的检测结果出现差异。
试剂厂商使用的标准物质的来源和质量也是造成维生素D检测结果出现差异的一个重要因素。厂商通常使用参考物质标定主标准曲线, 但提供给实验室客户的却是各自的校准品, 这直接导致了不同厂商间检测结果的差异。
四、维生素D标准化计划
为了解决维生素D检测面临的实际问题, 提供给临床更准确的信息, 保障患者的医疗安全, 美国国立卫生研究院（the National Institutes of Health, NIH）营养健康办公室（the Office of Dietary Supplements, ODS）与美国疾病预防控制中心（the Center for Disease Control and Prevention, CDC）、美国国家标准和技术研究院（the National Institute of Standards and Technology, NIST）和比利时根特大学一同合作, 启动了VDSP。
建立VDSP的宗旨是促进全球所有实验室25（OH）D检测方法（包括商业化和自建方法）的标准化, 从而提高医疗安全, 保障全民健康。在此基础上, NIH-ODS提出了VDSP的4个主要目标：（1）标准化各种厂商和实验室自建的25（OH）D检测方法; （2）标准化全民营养健康调查所使用的各种25（OH）D检测方法; （3）实施致力于改进实验室25（OH）D检测方法性能的国际化研究; （4）研究并报道25（OH）D标准化后的结果差异。
标准化的实现必须具备3个关键要素：参考测量体系的建立、溯源性的建立和终端用户的检测性能保证。VDSP对于25（OH）D标准化的实现制定了3个具体步骤, 见图1。
（一）建立参考测量体系
VDSP的参考测量体系主要包括用于定值的参考测量程序（reference measurement procedure, RMP）、用于溯源性传递的SRM、评估检测方法性能的导则文件及认证程序、有准确度保证的PT/EQA计划。见表1。
1.参考测量程序
NIST和比利时根特大学先后建立了同位素稀释-液相串联质谱法（isotope-diluted-liquid chromatography tandem-mass spectrometry, ID-LC-MS/MS）检测25（OH）D[包括25（OH）D2、25（OH）D3和3-epi-25（OH）D]的参考方法, 并被国际标准化组织认证并纳入检验医学溯源性联合委员会（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine, JCTLM）数据库中。
2.标准参考物质
目前NIST可提供SRM2972和SRM972用于25（OH）D检测方法的校准。由于互通性的问题, SRM2972仅适用于色谱或质谱法的校准。SRM972包含4份不同浓度的25（OH）D混合血清：水平1仅包含人血清, 以维生素D3为主; 水平2由人血清和马血清等比例组成, 含有较多的维生素D2; 水平3为服用维生素D2补充制剂的人血清, 含有等量的维生素D2和维生素D3; 水平4为添加了外源性3-epi-25（OH）D的人血清, 含有较多的3-epi-25（OH）D。SRM972适用于所有LC-MS/MS方法的校准。但对于免疫学检测方法, 由于外源性物质的基质效应影响, 仅水平1血清适用。SRM972一旦用完, NIST将提供SRM972a作为补充。SRMs与用于准确度评估的PT/EQA物质具有互通性是VDSP的一个重要环节。2013年VDSP通过初步试验证明SRM972a、CAP和DEQAS评估物质具有较好的互通性 。
3.性能验证程序
为保障25（OH）D检测结果的准确性, 2010年NIH-ODS与CDC合作建立了维生素D标准化认证程序, 并号召所有的生产厂商和实验室积极参与。该认证程序分2个阶段进行（见图2）, 首季度发放40份参考方法（JCTLM认证）定值的血清用于校准, 保证厂商或实验室自建方法的结果具有溯源性。随后, 每季度发放10份盲样样本用于精密度及准确度评估。参加者连续4次的调查结果符合认证程序的要求即颁发认可证书, 有效期为1年。重新认证是1年1次, 维生素D的性能验证标准是平均偏差≤ 5%, 不精密度≤ 10%。
4.PT/EQA
在具有准确度的PT/EQA计划中, 目前可供选择的有英国的DEQAS和CAP的基于准确性的维生素D计划（the Accuracy-based Vitamin D Program, ABVD）, 均为收费服务, 通过评估样本对实验室25（OH）D检测结果的准确性进行评定, 并发放合格证书。DEQAS按季发放含不同浓度维生素D代谢产物的人血清样本, 样本中25（OH）D2、25（OH）D3和3-epi-25（OH）D3经参考方法进行定值。CAP-ABVD配制含不同浓度25（OH）D2和25（OH）D3的人血清混合样本, 并用LC-MS/MS（可溯源至RMP）进行定值。此外, 实验室还可以参加NIST-NIH组织的VitDQAP项目。该项目对任何想要参加的实验室免费开放（http：//www.nist.gov/mml/csd/vitdqap.cfm）, 每年在夏、冬两季发放评估样本。此项目不对参加实验室进行评分, 仅提供综合性的数据分析报告, 同时NIST的专家们可以为实验室提供技术支持, 帮助实验室发现并纠正检测方法中的问题。
（二）建立商业化方法和实验室自建方法检测结果的溯源性
大部分临床实验室都使用商业方法来检测25（OH）D。因此商业化方法在整个VDSP中扮演着至关重要的角色, 见图3。VDSP倡导所有厂商均应积极参与到标准化计划中。目前, 大部分的厂商已使用NIST的SRM对其方法进行校准, 并且参加了美国CDC的标准化认证程序, 保证了检测结果的准确性。美国CDC甚至计划在其官网上颁布获得认证的检测方法名录, 以此促使所有厂商均参与到VDSP中。VDSP希望在RMP、厂商和实验室间建立一条坚不可摧的溯源链, 使检测结果与RMP一致, 从而保证检测结果的真实可靠。
一些大型的临床实验室在自建25（OH）D检测方法时也开始使用SRMs, 并参与到标准化认证程序中, 以保证自建方法的准确性。但美国CDC的计划太过昂贵, 且认证有效期仅有1年, 需要持续的长期参与, 因此并不是常规临床实验室或研究所的实用解决办法。对于这些实验室, 可参加有准确度保证的PT或EQA计划, 并根据反馈结果进行调整, 以此来保证结果的准确性。
（三）验证“ 终端用户” 的方法性能
为保证“ 终端用户” 的检测结果可以溯源至RMP且具有可比性, VDSP要求开展25（OH）D检测的各类实验室需要对所选择的检测方法定期进行分析性能验证, 并符合VDSP倡导的评价标准, 见表3。此项工作可以通过参加美国CDC的维生素D标准化认证程序或具有准确度保证的PT/EQA计划来完成。
五、结论
经过4年的努力, VDSP取得了实质性的进展。参考测量体系的完善, 使越来越多的厂商和大型临床实验室加入到美国CDC标准化认证程序的行列中。CAP、DEQAS和VitDQAP参加实验室数的与日俱增, 使其获得了更全面的数据, 得以改善VDSP的进一步规划。但要达到全球25（OH）D检测结果一致的目的仍然任重而道远, 尤其是以往的研究结果与各类公共健康导则的修正问题。如何跨越这一障碍, 需要临床专家、实验室专家以及VDSP相关人员的共同努力。
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