血清肿瘤标志物HE4检测在肺癌诊断中的应用价值探讨
作者：复旦大学附属肿瘤医院肖然, 胡昊昀, 王瑞, 卢仁泉, 郭林肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,多起源于支气管黏膜上皮。在全世界范围内,肺癌的发病率和死亡率居于首位[ 1]。肺癌在我国的发病率逐年提高,已成为我国男性发病率居第1位、女性居第2位的肿瘤,其病死率位居所有肿瘤之首。肺癌多见于男性,男女之比为3∶1~5∶1[ 2]。目前,临床上肺癌的常用肿瘤标志物有鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen, SCC)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)、细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)、胃泌素释放肽前体等,但单一肿瘤标志物对肺癌的诊断尚缺乏足够的诊断效率,特别是对肺腺癌的诊断,肿瘤标志物的敏感性和特异性均不高。人附睾蛋白4(human epididymis protein 4,HE4)是一种近年来发现的肿瘤标志物,其在正常组织中含量极低,大量文献报道HE4可用于卵巢癌的早期辅助诊断和疗效监测。国外已有文献报道HE4也可用于肺癌的早期辅助诊断,本研究旨在探讨HE4检测在肺癌诊断中的应用价值。
材料和方法
一、免疫组化测定
1. 材料 组织切片来自复旦大学附属肿瘤医院,其中肺腺癌患者4例,肺鳞癌患者2例,癌旁组织石蜡切片2例,所有病例均经病理证实。兔抗HE4抗体和抗兔IgG购自Abcam公司。
2. 方法 抗原修复采用煮沸修复法。免疫组织化学染色方法采用Envision二步法,具体操作步骤见参考文献[ 3]。
二、HE4血清学水平的检测
1. 研究对象 2011年8月至2013年2月复旦大学附属肿瘤医院住院肺癌患者共214例,男139例,女75例,年龄(57.0±11.0)岁,其中腺癌130例,鳞癌59例,未分化癌15例,小细胞癌10例,所有病例均经临床、病理等确诊。标本均采集于手术前。正常对照组为体检健康者76名,男36名,女40名,年龄(47.5±8.5)岁,均无肝、肾、生殖等系统疾病。
2. 方法 (1)标本收集:术前空腹静脉采血5 mL,混匀,室温静置1 h左右,以4 000 × g分离血清,-70 ℃冰箱冻存待用;(2) 肿瘤标志物测定:HE4测定用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),试剂由瑞典CanAg Diagnostics公司提供,严格按照试剂盒说明书操作。SCC检测使用雅培ARCHITECT i2000化学发光分析仪,试剂为雅培公司配套产品。CEA、CYFRA21-1、NSE检测使用罗氏Cobase601电化学发光分析仪,试剂由罗氏公司提供。
三、统计学方法
数据比较及受试者工作特性(receiver operating characteristic,ROC)曲线下面积用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料分析结果用中位数(四分位数)表示,组间比较采用非参数秩和检验;联合检测采用 χ2检验。以 P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、不同病理类型肺组织免疫组化结果
HE4在2例肺癌旁组织中均呈阴性表达,而在2例肺鳞癌中呈弱阳性表达,在4例肺腺癌中均呈强阳性表达,表现为棕黄色着色,主要分布在细胞质及细胞周围。见图1。
图1 HE4在肺癌组织及癌旁组织中的表达情况
二、不同病理类型肺癌组和正常对照组HE4检测水平比较
肺癌组患者血清HE4水平明显高于正常对照组,差异具有统计学意义( P<0.01),其阳性率为69.16%;但在肺癌的不同类型中,血清HE4水平并无明显差异,见表1。
三、HE4、CYFRA21-1及CEA在非小细胞肺癌中的诊断效率比较
HE4 、CYFRA21-1及CEA在非小细胞肺癌中的阳性率分别为68.63%、63.73%及36.27%,HE4明显高于CEA,差异具有统计学意义( P<0.01);HE4的阳性率略高于CYFRA21-1,但差异无统计学意义( P=0.346)。通过非小细胞肺癌患者和正常人的HE4、CYFRA21-1及CEA测定值绘制ROC曲线后发现,曲线下面积分别为0.874、0.823和0.817。在非小细胞肺癌的检测时,HE4优于CYFRA21-1及CEA。见图2。
图2 HE4、CYFRA21-1、CEA对非小细胞肺癌诊断的效能比较
四、肿瘤标志物联合检测的比较
在肿瘤标志物的联合检测分析中,常用的肺癌4项检测指标(SCC、CEA、CYFRA21-1、NSE)对肺癌的检出阳性率为79.44%;当HE4参与联合检测后,阳性率显著提升为89.72%,差异具有统计学意义( P=0 .003),见表2。在对肺腺癌的诊断中,CEA和CYFRA21-1联合检测的检出阳性率为68.46%,HE4参与联合检测的检出阳性率为82.31%,差异亦具有统计学意义( P<0.05),见表3。
讨论
HE4基因是Kirchhoff等[ 4]于1991年在人附睾远端上皮细胞中发现的,该基因位于人染色体20q12-13.1,并认为HE4是 WFDC2基因的编码产物,是一个酸性的单信号肽和半胱氨酸丰富的多肽为特点的分泌蛋白,是一种乳酸蛋白(whey acidic protein,WAP)。Hellström等[ 5]筛选获得了HE4蛋白,证明在WAP结构域中有一个抑制性的环结构,可以插入到蛋白酶活性结构区而达到抑制蛋白酶的作用。HE4在女性生殖系统上皮(包括输卵管上皮、子宫内膜腺体、宫颈内腺体和前庭大腺)及男性生殖系统的附睾及输精管上皮中高表达,特别是在上皮性卵巢癌中呈高表达,国内外有关HE4在卵巢癌中应用的研究已有报道[ 6],在其他组织中如卵巢、胃肠道、肝脏等组织中不表达[ 7]。
HE4作为一种新的肿瘤标志物,国外有研究表明其在肺腺癌中有高表达,在肺鳞癌中也有中等程度的表达[ 7, 8]。国内亦有文献报道,HE4在肺癌患者中阳性率明显高于肺良性疾病组,差异有统计学意义( P<0.05)[ 9]。根据本研究的免疫组化结果,HE4在肺腺癌中细胞质呈现为强阳性,在肺鳞癌中细胞质也有阳性表达,不过阳性表达程度没有肺腺癌中高,与Galgano等[ 7]的研究结果基本吻合。Bingle等[ 10]把HE4检测作为一个潜在有用的新的肿瘤标志物,对呼吸道疾病和肺癌的发生、发展之间的关系作了有效的实验分析和监测。本研究对HE4进行血清学水平上的检测,与正常对照者比较,其在不同病理类型的肺癌患者中均有所增高( P<0.05)。正常对照组的HE4阳性率仅为6.58%,真阴性率达到93.42%,可以看出HE4的特异性较好。在肺腺癌和肺鳞癌的对比中,并没有得到预期的肺腺癌高于肺鳞癌的结果,但本研究中腺癌患者的HE4水平分布较宽,且腺癌的高值水平较鳞癌高,这可能与肺癌特定的病理类型有关,尚待进一步研究。而小细胞肺癌患者中HE4血清含量增高,这可能与标本数量不足有关。
CYFRA21-1是已被推广的肺癌肿瘤标志物,主要由细胞角蛋白19的2个单克隆抗体组成,存在于单层和复层上皮肿瘤的胞质中,细胞溶解时血清中的CYFRA21-1含量会升高[ 11]。现在CYFRA21-1已作为检测非小细胞肺癌的首选肿瘤标志物,而CEA作为肺癌的辅助诊断标志物也被广泛认可。为了验证HE4在检测非小细胞肺癌中的敏感性和特异性,选择将HE4与CYFRA21-1及CEA进行对比。从ROC曲线结果看出,HE4的敏感性和特异性优于CYFRA21-1及CEA,在非小细胞肺癌的检测中,HE4检测有良好的应用价值。
在肿瘤标志物联合检测中,相比于现在常用的肺癌肿瘤标志物(SCC、CEA、CYFRA21-1、NSE),HE4参与的联合检测明显高于传统的检测指标组合,阳性率高达89.72%( P<0.05)。由于样本量的局限性,对于HE4在各不同病理类型的肺癌中的作用没有得到详细分析,从现有的数据可以看出,HE4、SCC、CYFRA21-1联合检测大大提升了肺鳞癌的检出阳性率;在小细胞肺癌中,NSE仍然是检测小细胞肺癌最好的肿瘤标志物;但在未分化癌中,HE4联合CEA有着较好的检测阳性率。目前用于肺腺癌诊断的肿瘤标志物特异性和敏感性均不高,因此我们特别分析了HE4检测在肺腺癌诊断中的应用,CEA和CYFRA21-1联合检测的检出阳性率为68.46%,HE4有效地提高了肺腺癌的检出率,联合检测的阳性率为82.31%。
综上所述,HE4在肺癌的诊断中具有较高的应用价值,我们还将继续研究HE4对肺癌的疾病进展、疗效监测方面的作用。相信随着对HE4在中国人群中研究的不断深入,HE4在肺癌中的临床应用将日趋广阔。
参考文献
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