罕见混合细菌感染所致股骨慢性骨髓炎1例
作者：刘颖, 吴俊, 张伯松, 童静, 董方单位：北京积水潭医院检验科
慢性骨髓炎多为急性骨髓炎治疗不及时或不彻底而致病情慢性发展的结果。其病情复杂, 病程较长, 治疗的失败率和复发率也较高, 给患者带来了极大的痛苦。有时由于不能找到真正的病原菌, 无法制定个体化的治疗方案, 导致抗菌药物滥用, 给临床治疗带来很大的困难。细菌培养结果是诊断慢性骨髓炎的金标准之一, 临床微生物实验室人员对慢性顽固性感染应给予极大的关注, 为临床治疗提供正确的病原学诊断, 并为其个体化治疗提供依据, 提高慢性顽固性感染的治愈率。
材料和方法
一、临床病例资料
患者, 男, 50岁, 藏族。自诉于1978年骑马时坠落致左大腿摔伤, 回家后1周出现肿胀, 自行予以夹板固定, 2周后局部出现红、肿、热、痛, 6周后局部出现波动感, 有巨大脓肿, 于当地县医院行切开引流术, 在家又自行用藏药治疗, 大部分伤口愈合, 少部分伤口一直流脓水。先后于北京某骨伤科研究所及山西省某医院行多次手术, 均未治愈。于2008年11月来北京积水潭医院就诊, 先后在2008年11、12月和2009年4、12月行左股骨扩大开创骨水泥抗菌药物药珠植入术, 术后伤口愈合良好。2011年伤口再次出现流脓, 再次入北京积水潭医院, 给予病灶清除及抗菌药物药珠植入术治疗, 术后伤口愈合良好出院。患者出院后恢复良好, 多次复查示血常规、红细胞沉降率、C反应蛋白正常, 但左膝仍僵直, 活动障碍。2014年11月24日又来北京积水潭医院就诊, 自诉约2个月前出现发热, 诊断为“ 带状疱疹病毒感染” , 经治疗后痊愈。2周前左大腿外侧伤口再次出现渗液, 为黄色稀薄液体, 伴左大腿疼痛; 1周前出现恶臭。该患者肢体无红肿, 无畏寒发热, 为进一步诊治收入院。左股骨干计算机断层平扫显示, 左侧骨股干中下端骨髓腔内多发填充影, 骨皮质增厚, 周围软组织紊乱增厚。诊断为股骨慢性骨髓炎。见图1。
图1 左股骨干计算机断层平扫
二、仪器与材料
血琼脂平板、麦康凯平板、巧克力琼脂平板和厌氧血琼脂平板购自天津市金章科技发展有限公司; 胰蛋白胨大豆肉汤培养基购自赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司。使用法国生物梅里埃公司API 20 A厌氧菌鉴定试剂盒鉴定厌氧菌; 采用法国生物梅里埃公司VITEK MS质谱分析仪鉴定少见菌（北京儿童医院）; 用美国BD公司PhoenixTM 100细菌鉴定药物敏感性分析仪进行常见菌鉴定及药物敏感性试验。细菌药物敏感性纸片购自英国OXOID公司; 细菌药物敏感性E-test试条购自法国生物梅里埃公司。
三、方法
1. 细菌培养与镜检
术中取伤口脓液、组织及髓腔内分必物6份, 分别接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板、厌氧血琼脂平板及胰蛋白胨大豆肉汤培养基上, 同时置厌氧、需氧和5%~10% CO2微需氧环境培养。培养同时, 进行涂片、革兰染色和镜检。厌氧培养阳性者, 进行耐氧试验, 明确其为厌氧菌。细菌培养方法按照《全国临床检验操作规程》（第3版）进行。
2. 细菌鉴定 培养出的细菌采用PhoenixTM 100细菌鉴定药物敏感性分析仪及其配套的鉴定卡进行常规鉴定; 鉴定不出的细菌, 采用VITEK MS质谱分析仪进行质谱分析; 厌氧菌则先进行革兰染色镜检, 再采用API 20 A厌氧菌鉴定试剂盒进行鉴定。所有鉴定操作均按照仪器和试剂说明书进行。
3. 体外药物敏感性试验 咽峡炎链球菌和嗜沫凝聚杆菌采用纸片扩散法进行体外药物敏感性试验, 结果判断参考美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）M100-S24。小韦荣球菌采用E-test法进行体外药物敏感性试验, 结果判断参考CLSI M11-A8。体外药物敏感性试验方法按照《全国临床检验操作规程》（第3版）进行。
结 果
一、细菌培养及鉴定
1. 样本直接涂片染色镜检
临床样本直接涂片、革兰染色镜检, 查见革兰阳性球菌、革兰阴性球菌和革兰阴性杆菌。
2. 初代培养
样本同时进行厌氧、需氧和5%~10% CO2微需氧培养72 h。厌氧血琼脂平板划线一区盲涂片, 见到大量革兰阴性小球菌、大量革兰阳性小球菌及少量革兰阴性小杆菌, 见图2。微需氧血琼脂平板划线一区盲涂片, 见到大量革兰阳性小球菌及大量革兰阴性较粗、长丝状菌, 见图3。
图2 厌氧血琼脂平板初代培养原始区混合涂片
图3 微需氧血琼脂平板初代培养原始区混合涂片
3. 细菌分纯培养及菌种鉴定
厌氧血琼脂平板上的菌落经过耐氧试验, 革兰阳性球菌为兼性厌氧菌, 经PhoenixTM 100细菌鉴定药物敏感性分析仪鉴定为咽峡炎链球菌; 革兰阴性球菌为专性厌氧菌, 厌氧要求较高, 72 h形成圆形、光滑、不透明、灰绿色、不溶血、中心凸起的菌落, 于紫外线下照射, 培养物能发出粉红色至红色荧光, 经API 20 A厌氧菌鉴定试剂盒鉴定为小韦荣球菌; 少量革兰阴性小杆菌经厌氧、需氧多次培养未见到, 后分析认为是微需氧菌嗜沫凝聚杆菌, 在厌氧初代培养中会有少量生长, 由于培养气体条件不符合, 经传代培养, 导致细菌死亡。鉴于革兰阴性长丝状菌在血琼脂平板和巧克力琼脂平板生长非常弱并被咽峡炎链球菌覆盖, 很难见到单个菌落, 分离单个菌落非常困难, 所以尝试采取了在血平板原始区贴万古霉素纸片抑制咽峡炎链球菌, 经72 h培养后, 从万古霉素抑菌圈内分离到了革兰阴性长丝状菌, 经VITEK MS质谱分析仪鉴定为嗜沫凝聚杆菌。嗜沫凝聚杆菌原归为嗜血杆菌属, 后划归为凝聚杆菌属, 营养要求较高, 需要5%~10% CO2气体环境, 培养基中需加入Ⅹ 、Ⅴ 因子。本株细菌经第2代纯培养, 呈革兰阴性长丝状, 菌体较初代培养细了很多, 见图4; 经第3代培养, 为革兰阴性弯曲的小杆菌, 比较符合一般教科书所述的细菌形态, 见图5。
图4 嗜沫凝聚杆菌第2代纯培养涂片
图5 嗜沫凝聚杆菌第3代纯培养涂片
二、体外药物敏感性试验
1. 咽峡炎链球菌纸片扩散法体外药物敏感性试验
头孢曲松：27 mm敏感; 头孢噻肟：30 mm敏感; 头孢吡肟：31 mm敏感; 左氧氟沙星：24 mm敏感; 利奈唑胺：27 mm敏感; 万古霉素：24 mm敏感; β -内酰胺酶阴性。
2. 嗜沫凝聚杆菌纸片扩散法体外药物敏感性试验
青霉素：20 mm敏感; 头孢噻肟：18 mm敏感; 庆大霉素：16 mm敏感; 哌拉西林-他唑巴坦：33 mm敏感; 美罗培南：36 mm敏感。
3. 小韦荣球菌体外药物敏感性试验
E-test法, 头孢噻肟：4 μ g/mL敏感; 甲硝唑：16 μ g/mL敏感; 哌拉西林-他唑巴坦：2 μ g/mL敏感。纸片扩散法药物敏感性试验, 美罗培南：30 mm敏感。
三、治疗方案
1. 抗菌药物的选择及治疗方案
根据细菌体外药物敏感性试验结果, 术前、术后选择静脉滴注哌拉西林-他唑巴坦6周, 剂量为4.5 g, 每8小时给药1次。骨水泥带亚胺培南、万古霉素; 人工骨带美罗培南、万古霉素局部治疗。
2. 手术治疗方案
第1次左股骨病灶清除, 带有亚胺培南、万古霉素的骨水泥链珠植入术; 第2次手术清创, 带有美罗培南、万古霉素的人工骨植入术, 肌瓣移植修复术。
四、患者疗效观察
哌拉西林-他唑巴坦抗感染治疗6周后, 改口服头孢3代联合莫西沙星继续治疗4周, 患者生命体征平稳, 神志清楚, 精神好, 已下地行走, 伤口无感染征象, 各项感染指标正常, 进一步指导患者进行主动踝关节屈伸活动及下肢肌肉等长收缩, 患者在保护下行走。
讨 论
对慢性骨髓炎病原菌的研究, 有学者认为金黄色葡萄球菌是其最常见的病原菌, 在培养阳性的病例中该菌占70%~90%。HOGAN等对401例骨髓炎患者作细菌培养, 结果显示金黄色葡萄球菌占29%, 表皮葡萄球菌占30%, 耐甲氧西林表皮葡萄球菌占13%, 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌占6.0%, 肠球菌占7.0%, 肠杆菌占5.4%, 铜绿假单胞菌占5.0%, 其他菌占4.6%。本研究中的患者是由创伤导致的慢性骨髓炎, 病程长。此次分离的致病菌为兼性厌氧菌、专性厌氧菌和微需氧菌3种少见菌, 鲜有报道。这可能与样本采集质量有很大的关系。单纯创面分泌物的培养对诊断来说是不够的, 应该于术中取多份样本进行培养, 包括脓液、组织及骨刮取物, 尤其是骨组织周围及髓腔内分泌物的培养十分必要。本研究患者的主管医生在手术中采集不同感染部位样本共6份, 同时做需氧、微需氧及厌氧培养, 是成功分离病原菌的重要前提条件。
在初代培养时, 除选择接种各种高营养培养基外, 培养时间必须在72 h以上, 才不至于漏掉如嗜沫凝聚杆菌这样的微需氧菌和小韦荣球菌这样缓慢生长的专性厌氧菌, 即便如此, 对于混合感染菌可能有时还会漏诊, 因为有一些缓慢生长的细菌可能需三四天甚至更长的时间才能在琼脂培养基三、四区看到肉眼可辨的单个菌落。为避免漏诊, 需要将血琼脂平板原始接种区盲涂片与三、四区肉眼可见单个菌落涂片菌体形态进行比较。此病例就是通过比较厌氧和微需氧血琼脂平板划线一区盲涂片, 革兰阴性小球菌在需氧环境中不生长, 推断厌氧菌的可能性较大; 革兰阴性、较粗、长丝状菌在厌氧环境中几乎不生长, 推断为需氧、微需氧菌的可能性较大, 此思路在挑取、分离菌落时有很大的指导意义, 加快了细菌分离培养的速度。对于培养基中混合生长的菌落, 可采取贴万古霉素纸片将革兰阳性球菌抑制, 在其抑菌圈内将革兰阴性、较粗、长丝状菌分离出来, 或也可用加万古霉素巧克力平板的方法分离此菌。此3种菌在感染组织中之所以能够共生, 是因为除培养条件各有其特殊性外, 还有一个共同的条件就是须有CO2气体存在。
对多种细菌混合感染患者做药物敏感性试验时, 所选抗菌药物要尽量同时覆盖分离的所有细菌, 普通细菌可参考CLSI M100-S24、厌氧菌参考CLSI M11-A8选择抗菌药物, 综合药物敏感性试验结果及治疗方式, 术前、术后选择静脉滴注哌拉西林-他唑巴坦; 手术清除左股骨病灶, 带有亚胺培南、万古霉素的骨水泥链珠植入术; 带有美罗培南、万古霉素的人工骨植入术, 肌瓣移植修复术。患者术后恢复良好。
对于慢性骨髓炎反复感染, 尤其是经过多次手术治疗的患者, 其受损部位组织的血液循环已比较差, 极易受到内源及外源性病源微生物的侵扰, 提高患者自身免疫力, 避免殃及到受损部位非常重要。本研究患者所分离的细菌可能是由于患者发病2个月前出现发热、带状疱疹病毒感染, 免疫力下降, 口腔或上呼吸道细菌通过血液进入骨髓组织所致。虽然患者目前治疗成功, 病情稳定, 但临床医生仍应该提醒患者在以后的生活中, 注意提高自身免疫力且减少受损肢体的负重, 使炎症不再复发。
此病例给临床医生和病原学实验室人员的启示是：责任心、细心、能力及相互沟通是解决疑难病例的重要因素。
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