聚合酶链反应
【摘要】 目的 建立结核分枝杆菌的PCR-酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，使PCR结果判定更加客观。方法 我们使用玻璃粉吸附提纯模板DNA，将PCR引物5′端标记生物素，用PCR产物与微孔板中预先包被的克隆靶基因杂交，然后用酶标链霉亲和素与杂交体中的生物素结合，最后用酶底物与所标记酶进行显色反应，通过测定其吸光度来判断结果。结果 所建立的PCR-ELISA检测法可提高检测的灵敏度和特异性。对50份来自结核病人高度怀疑有结核分枝杆菌的标本检测表明，PCR-ELISA检出22份阳性，比抗酸染色法(7/50)、培养法(13/50)和PCR-电泳法(18/50)检出率高，而20份证实无结核分枝杆菌的标本，几种方法检查均为阴性。结论 该法可敏感、特异和客观地检测临床标本中的结核分枝杆菌。从80年代中期以来，全球结核病患者人数呈上升趋势。自1989年聚合酶链反应(PCR)用于结核分枝杆菌检测以来，该技术已广泛应用于结核病的诊断，并已显示出很多优点。但在临床应用时，此技术还是遇到了很多问题，比如灵敏度和特异性问题，污染问题，因为存在Taq DNA聚合酶抑制物质而致假阴性结果［1，2］。虽然可以通过斑点杂交，Southern杂交法提高PCR的灵敏度和特异性，但是，这些方法复杂，又不适合用于大量标本的检测，故其不适合于临床应用；另外，套式PCR可以提高特异性，但增加了污染的危险［1］。在参考国外现有文献的基础上，我们建立了结核分枝杆菌的PCR-微孔板杂交检测法，报告如下。
材料和方法
一、菌株
本实验所用菌株均经常规鉴定，分枝杆菌属内不同种菌株(包括脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈登分枝杆菌、微黄分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、无色分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、猿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌、蟾分枝杆菌)的DNA由日本歧阜大学江崎孝行教授惠赠，其他菌株(包括嗜肺军团杆菌、肺炎支原体、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌)由军事医学科学院微生物流行病研究所保存，结核分枝杆菌临床分离株来自成都市结核病医院。
二、标本处理
采用裂解液裂解，玻璃粉吸附法提取菌株及标本中的DNA，痰标本采用NaOH液化［4］。
三、PCR引物的设计
以结核分枝杆菌IS6110插入序列为靶序列，用SEQNCE，PRIMERS，PCRDESN和OLIGO等软件设计了一对各20 mer的引物，引物1为5′GCT GTG GGT AGC AGA CCT AT3′，引物2为5′TAC TGG TAG AGG CGG CGA TT3′，扩增一443 bp的DNA片段，引物5′端修饰Bio-ll-dUTP，引物由美国赛百盛公司合成。
四、PCR条件(特异性和灵敏度)
PCR条件：30 μl反应体系中含10 mmol/L Tri-HCl(pH8.4)，50 mmol/L KCl，2.0 mmol/L MgCl2，0.01%明胶，200 μm各dNTP。两条引物浓度各为100 pmol/L，1U TaqDNA聚合酶(dNTP和TaqDNA聚合酶购自Promega公司)。加入27 μl标本提取液。在PTC51B热循环仪(军事医学科学院产)上进行扩增，循环参数为94℃变性3分钟，94℃40秒，58℃40秒，72℃40秒，20次循环后，72℃延伸5分钟。
特异性试验：将与结核分枝杆菌缘距较近的细菌与结核分枝杆菌进行同样扩增，杂交，显色。
灵敏度试验：将结核分枝杆菌标准株(H37Rv)所提模板DNA定量后，进行对倍稀释，分别进行同条件的PCR扩增，电泳，杂交，显色。
五、包被探针的克隆
用未标记引物行PCR扩增获得特异片段，用QiAgen PCR产物纯化试剂盒纯化产物，与T-载体(Promega T-vector)连接过夜后(按试剂盒说明书操作)，转化用CaCl2制备的感受态大肠杆菌JM109，用含X-gal和IPTG的青霉素平板以蓝白菌落为标志，挑选含插入片段的白色菌落，用质粒提取和PCR来鉴定重组子［5］。
六、微孔板杂交
包被：用QiAgen Plasmid purification kit从重组子中提取质粒，定量后，用包被液PBS-Mg2+分别配成10，7，5，3 μg/ml浓度，热变性后，每孔以100 μl包被NUNC Maxisorp单条可拆微孔板，4℃过夜，次日以漂洗液(PBS-0.1% Tween 20)洗3次，45℃干燥待用［6］。
预杂交：加预杂交液(5×SSC，5×Denhardt′s，50 μg/ml鲑鱼精DNA，10%硫酸葡聚糖)200 μl于包被的微孔板中，50℃预杂交1小时。PCR产物的获得：待检菌株或标本DNA经5′端修饰生物素引物行PCR扩增，循环次数分别设定为10，15，20，25，30，35次，PCR产物经100℃5分钟变性，立即冰浴10分钟使成单链，分别将单链PCR产物20 μl加入预杂交液100 μl中。杂交：将上述含变性产物的预杂交液100 μl加入预杂交的微孔中，50℃杂交，时间分别设定10，15，30，90，120，180，240分钟。漂洗：弃去杂交液，用2×SSC洗4次，0.5×SSC洗2次，或用PBS-0.1%TWEEN20洗5次。
<P> 显色：加或不加入封闭液(PBS-0.1% Tween，5%BSA)封闭1小时后，漂洗
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