尿白蛋白检测现存问题与解决方案
作者：俸家富单位：四川医科大学附属绵阳市中心医院检验科
1982年Viberti等发现1型糖尿病患者尿总蛋白在参考区间内，而尿白蛋白(urine albumin, UAlb)排泄增加，提出了"微量白蛋白尿(microalbuminuria)"概念。尿微量白蛋白(urine microalbumin)是指尿中含量超出健康人参考区间，又不能用传统方法(如磺柳酸法或试带法等)检测出的白蛋白(albumin，Alb)，其本质是Alb，来源于血浆，与血浆白蛋白同质。2009年前，将UAlb排泄在30～300 mg/d，或其随机尿浓度为20～200 mg/L，或白蛋白排泄率(albumin excretion rate，AER)在30～300 mg/d之间的尿称为"微量白蛋白尿"。
为解决UAlb现有检测方法学存在的问题，美国肾病教育计划(National Kidney Disease Education Program，NKDE)和国际临床化学联合会(International Federation of Clinical Chemistry，IFCC)尿白蛋白检测实验室工作组，共同起草了"尿白蛋白检测和报告现存问题"的专家共识。建议使用术语"尿白蛋白"，摒弃"微量白蛋白(microalbumin)"，以避免"微量白蛋白"与"小白蛋白分子(small albumin molecule)"相混淆。改善全球肾脏病预后组织(Kidney Disease: Improving Global Outcomes, KDIGO)在2012年发布的慢性肾病治疗指南中也建议不再使用术语"微量白蛋白尿"。如今，术语"微量白蛋白尿"与"尿微量白蛋白"还在某些领域使用，诣在警示糖尿病、心血管疾病患者易发慢性肾病高风险的可能。
一、尿白蛋白检测的现存问题
尿白蛋白检测准确度问题存在两大方面争议。首先，越来越多的人认识到尿中存在修饰性Alb或Alb片段，(1)尿液中修饰Alb百分比较血液高；(2)糖尿病患者尿中Alb异构体和酸性Alb较多；(3)尿中存在多种类型的Alb片段。但UAlb检测却使用血清Alb作校准。因此，缺乏对Alb片段导致UAlb检测结果影响的分析。其次，方法学上，没有认可的UAlb常规免疫学测定方法。体积排阻色谱法(size–exclusion–high–performance liquid chromatography，SE–HPLC)虽可检测出尿中Alb片段，但仪器成本高，技术难度大，且难与同体积小分子蛋白区分，导致高估一些UAlb检测结果。此外，样本的选择、报告方式以及判定值设定等方面均可能影响UAlb检测结果。
(一)分析前变异
1．生理变化：
个体生物学差异可致UAlb排泄率4%～103%的变化。
2．样本收集与贮存：
(1)容器影响：Alb易吸附在塑料容器表面，导致UAlb检测结果偏低。(2)贮存影响：不同温度下，UAlb稳定性不同。(3)防腐剂影响：防腐剂的应用缺乏统一规定，不同临床实验室对其选择可能不同。
UAlb分子的存在形式及免疫反应性：尿中Alb分子因化学修饰和(或)酶降解等生化作用，常以多种结构形式存在于尿液。不同的检测方法所检测的Alb分子片段不尽相同，致使检测结果迥异(表1)。
除上述客观条件的影响外，人UAlb的排出量至少还受以下因素的影响：体位、运动、血压、蛋白摄入量、体温、情绪及药物(青霉素、心痛定、乙酰水杨酸、去甲肾上腺素)等可致UAlb浓度升高。
（二）、检测方法变异
1．临床实验室检测：
临床实验室检测UAlb的方法有免疫学法和色谱法两大类，免疫学法只能检测具有免疫反应性的UAlb，且其相对分子质量>12 000；但是，当血中Alb流经肾脏时，受溶酶体酶的作用，>99%被生化修饰，形成分子大小不等的Alb衍生片段。SE–HPLC是一种主要以分子体积大小来进行分离的方法，能同时检测具有免疫反应性和非免疫反应性的UAlb。
目前UAlb定量尚无决定性方法，候选方法有SE–HPLC，液相色谱串联质谱法(liguid chromatography–tandem mass spectrometry，LC–MS/MS)等。该法只能检测带N末端的UAlb，不能检测所有Alb片段。此外，由于受高信噪比影响，UAlb<20 mg/L时，结果可靠性差。利用同位素稀释质谱和多反应监测技术，有学者建立了稳定同位素稀释多反应监测质谱之UAlb绝对定量方法。该法用15N同位素标记的全长重组人血清Alb作内标，利用该内标与被测UAlb有相同或相近的理化性质，使二者充分混合，其比值基本不受其他因素的影响，从而达到UAlb绝对定量的目的。不过，操作耗时，仪器昂贵，使许多实验室可望而不可及。
2．POCT检测：
近年来，发展了床旁检验(point–of–care test，POCT)来筛查有肾病风险的高危人群。一个系统回顾和荟萃分析显示：半定量和定量检测的阴性似然比分别为0.26(95%CI，0.16～0.40)和0.04(95%CI，0.01～0.25)。可见，半定量POCT检测阴性结果不能排除白蛋白尿，定量POCT检测虽可用于排除白蛋白尿，但所设定的判断线均为30 mg/g(3.4 mg/mmol)，不满足美国国家肾脏基金会(National Kidney Founclation，NKF)和FDA<10 mg/d(或Alb mg/g Cr)之要求。
3．实验室间的变异：
用多克隆抗体能与一些降解的Alb和其碎片发生反应，而单克隆抗体则可能因Alb分子降解或断裂导致某些非特异性结合抗原位点不被检测。由于不同实验室采用的检测方法不同，导致尿Alb的检测结果有所不同，甚至完全没有可比性。
（三）、参考区间问题
白蛋白尿起源于对糖尿病患者肾功能损伤的研究，其参考值上线为30～300 mg/24 h，或在30～300 mg/g (UAlb/Cr)。美国糖尿病学会就建议将筛查心血管风险患者肾功能损伤的UAlb降为20 μg/min。对中国人口的研究发现，ACR正常上限男性低于女性，分别为14 mg/g和20 mg/g。年龄、血压和eGFR均与ACR值相关。此外，参考区间的确定与检测方法有关。比如，SCr现多用肌氨酸氧化酶法检测，而非制定参考值上线时所用的Jaffe's动力学法。
（四）、报告单位问题
UAlb定量通常以单位时间(多用24 h)内Alb的排泄量(AER)来表示，AER是检测UAlb的"金标准"，结果较ACR可靠。但收集24 h尿样困难，因此许多国家指南和文献推荐使用不定时尿液，以白蛋白肌酐比(ACR)报告。大量研究表明，无论定时尿还是随机尿，ACR与AER均高度相关。
根据习惯和检测方法不同，尿Alb检测的报告单位截然不同，总体显得混乱，容易引起混淆。尿Alb检测常见报告单位有："mg/L"、"μg/L"、"μg/ml"、"mg/min"、"mg/h"或"g/24 h"；尿ACR常见报告单位有："mg/mmol Cr"、"g/mol Cr"、"mg/g Cr"或"mg/mg Cr"。这种现况反映了某个国家或地区习惯问题，且难于统一。
二、尿白蛋白检测的解决方案
(一)样本采集与处理
1．容器的选择：
塑料会吸附Alb，导致低浓度UAlb样本的检测结果偏低。因此，用塑料容器盛装尿样时，应留取足够体积量，以降低UAlb的相对损失。
因为塑料会吸附Alb，所以应避免使用未经处理的塑料容器盛装尿样本。
2．样本贮存与转运：
尿液留取后应立即送检，2 h内完成检测。若不能即时检测，可按下述方式保存和转运。(1)IFCC工作组提出的贮存温度影响：–80℃冰冻可长期保存；高于–80℃，尤其在–20℃，可形成变异体；2～8℃，可稳定7 d。(2) WHO推荐(WHO/DIL/LAB/99.1 Rev.2)：4～8℃，稳定1个月；20～25℃，稳定7 d。WHO与IFCC提出的存储温度影响有较大不同，最好参照IFCC提出的贮存温度影响。(3)无冷藏条件时，可加0.1%叠氮钠或1.0 g/L硼酸防腐。(4)样本运送应密闭，并防止高温和阳光直射。
(二)试剂选择
免疫学法是UAlb临床实验室常规检测方法。由于Alb分子有多个抗原结合位点，所以，方法学选择时应挑选多克隆抗血清试剂盒，以尽可能检测降解后的Alb分子片段，从而提高检测的敏感度和阳性率，避免漏检。
(三)方法敏感度
2009年，由美国NKF和FDA发起研讨会，将UAlb参考区间作了调整，由原<30 mg/d(或Alb mg/g Cr)降为<10 mg/d(或Alb mg/g Cr)。该参考值的改变表明NKF和FDA对有肾病高风险的人群更加关注，也表明肾功能的损伤出现在30 mg/d(或Alb mg/g Cr)之前。这就要求所选用的UAlb检测方法，其检测敏感度必须<10 mg/L。
三、我国现状与展望
迄今为止，我国尚未颁布UAlb检测统一指南。目前国内多用免疫透射比浊法检测UAlb，部分方法所用参考物质可溯源至ERM–DA 470/IFCC，部分方法之检测结果可靠性还有待改善。实验室检测方面，LC–MS/MS和SID–MRM–MS测定UAlb的方法日趋成熟，为UAlb参考方法的确定奠定了基础。
参考文献
VibertiGC, HillRD, JarrettRJ, et al. Microalbuminuria as a predictor of clinical nephropathy in insulin-dependent diabetes mellitus. Lancet, 1982, 1(8287):1430-1432.
MillerWG, BrunsDE. Laboratory issues in measuring and reporting urine albumin. Nephrol Dial Transplant, 2009, 24(3):717-718.
MillerWG, BrunsDE, HortinGL, et al. Current issues in measurement and reporting of urinary albumin excretion. ClinChem, 2009, 55(1):24-38.
GEknoyan, NLameire, KUEckardt, et al. KDIGO 2012 Clinical Practice Guidelines for the evaluation and Management of Chronic Kidney Disease. Kidney IntSuppl, 2013, 3(4):81-90.
BruschiM, SantucciL, CandianoG, et al. Albumin heterogeneity in low-abundance fluids. The case of urine and cerebro-spinal fluid. BiochimBiophysActa, 2013, 12(1830):5503-5508.
SviridovD, DrakeSK, HortinGL. Reactivity of urinary albumin (microalbumin) assays with fragmented or modified albumin. ClinChem, 2008, 54(1):61-68.
ZhangM, FuG, LeiT. Two urinary peptides associated closely with type 2 diabetes mellitus. PLoS One, 2015, 10(4):e0122950.
YuY, SikorskiP, Bowman-GholstonC, et al. Diagnosing inflammation and infection in the urinary system via proteomics. J Transl Med, 2015, 13:111.
ViswanathanG, UpadhyayA. Assessment of proteinuria. Adv Chronic Kidney Dis, 2011, 18(4):243-248.
BargnouxAS, BarrotA, FeslerP, et al. evaluation of five immunoturbidimetric assays for urinary albumin quantification and their impact on albuminuria categorization. Clin Biochem, 2014, 47(16-17):250-253.
郭玮，潘柏申．尿白蛋白检测标准化进展及实验室应注意的问题．中华检验医学杂志，2015，38(9)：577-579.
王华斌，刘蕊．人群白蛋白尿发生率及影响因素的研究进展．中华检验医学杂志，2014，37(12)：973-976.
Beasley-GreenA, BurrisNM, BunkDM, et al. Multiplexed LC-MS/MS assay for urine albumin. J Proteome Res, 2014, 13(9):3930-3939
McTaggartMP, NewallRG, HirstJA, et al. Diagnostic accuracy of point-of-care tests for detecting albuminuria: a systematic review and meta-analysis. Ann Intern Med, 2014, 160(8):550-557.
张岩，谭延国，谢夏武．尿液微量白蛋白快速筛查方法应用的评估．中华检验医学杂志，2012，35(7)：647-649.
SacksDB, ArnoldM, BakrisGL, et al. Guidelines and recommendations for laboratory analysis in the diagnosis and management of diabetes mellitus. Clin Chem, 2011, 57(6):e1-e47.
王芳，张路霞，张普洪，等．人群调查中尿白蛋白检测方法的探讨．中华检验医学杂志，2011，34(3)：240-244.
FagerstromP, SallstenG, AkerstromM, et al. Urinary albumin excretion in healthy adults: a cross sectional study of 24-hour versus timed overnight samples and impact of GFR and other personal characteristics. BMC Nephrol, 2015, 16(1):8.
王学晶，徐国宾，张捷．常规尿白蛋白检测系统的分析与性能评价．中华检验医学杂志，2012，35(11)：1038-1044.
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[1]