尿蛋白电泳检测在早期糖尿病肾病中的应用
作者：饶绘1, 臧莉2, 润袁敏1, 皮佑珺1单位：1.襄阳市中心医院检验医学部, 2.襄阳市中心医院肾内科
引言
糖尿病肾病 (diabetic nephropathy,DN) 是糖尿病(diabetes mellitus,DM)全身微血管并发症之一,也是导致慢性肾衰竭的主要原因之一。糖尿病患者定期筛查可发现早期DN,通过适当治疗常可逆转早期病变。因此, DN的筛查引起了临床的重视[ 1]。目前临床应用较多的早期DN诊断指标是尿微量白蛋白(microalbumin,mAlb),后者出现提示肾小球早期损害。然而,近来研究显示早期DN的肾小管损伤独立于肾小球[ 2, 3],其出现甚至可能早于肾小球。那么代表肾小管重吸收障碍的肾小管性蛋白尿在早期DN的出现情况如何呢?我们使用单次测定可反映蛋白谱全貌的尿蛋白电泳法加以探讨,考虑到尿蛋白电泳的检出限(15 mg/L),我们对DM伴随微量和极微量白蛋白尿(15~300 mg/24 h)的患者进行分析,观察早期DN肾小管性蛋白尿的出现情况。
材料和方法
一、对象
对襄阳市中心医院门诊2型DM患者进行尿mAlb测定,选择结果为 15~300 mg/24 h的患者48例进行尿蛋白电泳分析,其中男20例、女28 例,年龄46~77 岁,患者DM病史平均为6年且均无临床DN史。正常对照组10名,均为无DN史和肾病史的正常体检者,年龄48~76岁。
二、仪器与试剂
法国Sebia 公司HYDRASYS全自动电泳仪及配套尿蛋白电泳试剂盒;科大创新GC-911 γ 放射免疫计数器及维坊三维公司尿白蛋白放射免疫分析试剂盒。糖化血红蛋白测定使用伯乐D10高效液相色谱分析仪和配套试剂,尿常规干化学法分析使用长春迪瑞H-500尿液分析仪和H10-Ⅱ试纸条。
三、方法
留取24 h尿,使用GC-911γ放射免疫计数器测定尿mAlb浓度,经换算得24 h尿mAlb含量。选择mAlb含量为 15~300 mg/24 h的病例进行尿蛋白电泳。具体步骤:将20 μL十二烷基磺酸钠与80 μL尿标本混匀后取5 μL点样于凝胶孔中,经HYDRASYS全自动电泳仪(20 ℃、225 V、44 mA)电泳30 min ,胶片取出后置染色槽内自动烘干、染色、脱色、固定,最后进行扫描分析。以尿蛋白电泳显示的蛋白尿类型进行分组比较,并以尿mAlb 30 mg/24 h为界分2组观察尿蛋白电泳结果。同时记录患者糖化血红蛋白(HbA1c)、尿糖、尿隐血等相关资料。正常对照组同时进行尿蛋白电泳。
尿蛋白电泳结果判断标准:(1)肾小管性蛋白尿,主要为低分子量蛋白条带,包括β2-微球蛋白、α1-微球蛋白、视黄醇结合蛋白、游离轻链等,含量较均一,而白蛋白比例不超过总蛋白的40%;(2)单纯白蛋白性肾小球性蛋白尿,仅见浅染的均一白蛋白条带;(3)选择性肾小球性蛋白尿,以白蛋白条带为主,伴随少量大分子蛋白成份和微量的小分子蛋白成份,其中大分子蛋白/白蛋白<0.2。见 图1。
图1 尿蛋白电泳图
注:1为单纯白蛋白性蛋白尿;2为肾小管性蛋白尿;3为无尿蛋白条带;4为选择性肾小球性蛋白尿
四、统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行统计分析。实验数据以±s表示。各组间尿蛋白扫描百分比结果比较采用方差分析。对肾小管性尿蛋白百分比与HbA1c、尿隐血、尿糖结果之间进行相关性分析。 P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
一、尿蛋白电泳扫描分析与24 h 尿mAlb定量结果
以尿蛋白电泳结果分组,48例2型糖尿病患者中表现为低分子蛋白为主的肾小管性蛋白尿8例(17%),以中、高分子蛋白为主的肾小球性蛋白尿有36例(75%)[包括单纯白蛋白性肾小球性蛋白尿32例(67%)、选择性肾小球性蛋白尿4例(8%)],未检出尿蛋白条带4例(8%)。各组间尿蛋白扫描百分比比较差异有统计学意义( P<0.05)。各组尿蛋白电泳扫描结果及尿mAlb定量结果见 表1。正常对照组均未检出尿蛋白条带。
以mAlb定量结果分组,>30~300 mg/24 h和15~30 mg/24 h的患者分别归为mAlb尿组(38例)和极微量白蛋白尿组(10例)。38例mAlb尿组标本经尿蛋白电泳均显示有尿蛋白条带,其中肾小管性蛋白尿6例(16%)、肾小球性蛋白尿32例(84%)[包括单纯白蛋白性肾小球性蛋白尿28例(74%)、选择性肾小球性蛋白尿4例(11%)]。10例极微量白蛋白尿组经尿蛋白电泳有6例显示有尿蛋白条带(60%)[包括肾小管性蛋白尿2例(20%)、单纯白蛋白性肾小球性蛋白尿4例(40%)],4例(40%)未检出尿蛋白条带。
二、2型DM患者实验室相关资料分析
48例2型DM患者肾小管性尿蛋白百分比、尿蛋白干化学定性、尿隐血、尿糖及HbA1c结果见 表2。肾小管性尿蛋白百分比与HbA1c异常(>6.5%)呈正相关( r=0.300)。与尿隐血、尿糖未见明显相关性。
讨论
由于近年来对早期DN发病机制的研究多集中于肾小球病变[ 4],临床广泛使用的早期DN筛查指标为代表肾小球损伤的尿mAlb检测。本研究结果显示,在mAlb结果为>30~300 mg/24 h的mAlb尿组中有38例经尿蛋白电泳均显示有蛋白条带,其中84%为以白蛋白为主的肾小球性蛋白尿,提示肾小球仍是早期DN肾损伤的主要部位,使用mAlb筛查可发现大部分早期DN患者。然而,在mAlb结果为15~30 mg/24 h的极微量白蛋白尿组中有2例为肾小管性蛋白尿。考虑到白蛋白在肾小管性蛋白尿中所占的比例(≤40%),肾小管性尿蛋白的排出并未能通过mAlb检测灵敏地反映出。这不仅显示在达到早期DN诊断标准之前小部分患者即开始有肾小管病变,也提示以mAlb >30~300 mg/24 h作为早期DN监测标准对肾小管性蛋白尿存在漏检的可能(25%,2/8)。
本研究结果显示,肾小管性蛋白尿在检出尿蛋白条带的患者中占18%(8/44),提示肾小管病变在DN发病早期的作用不容忽视。此时伴随的尿mAlb定量多位于正常或轻度异常范围[(119±91) mg/24 h,其中2例≤30 mg/24 h],提示肾小管病变可能独立于肾小球病变,其发生甚至可能早于肾小球病变,这与Thomas等[ 3]对肾超微结构的研究结果相符。检测原理为针对白蛋白的干化学法尿蛋白定性试验检测肾小管性蛋白尿时,其结果亦为阴性(5/8)和弱阳性(3/8)。这种位于正常或轻度异常范围的结果常不足以引起临床的充分重视,从而可能错过早期对症治疗的时机。因此,对早期DN的筛查有必要在尿mAlb之外,增加对肾小管性尿蛋白的早期检测。本研究肾小管性蛋白尿多伴随HbA1c异常。持续高血糖状态下患者体内氧自由基产生过多,同时糖进入肾近曲小管细胞并不依赖胰岛素使近曲小管对慢性高血糖的有害作用更敏感[ 2]。提示合理调控血糖可能是减少早期DN肾小管损伤的重要措施之一。本研究病例中未发现非选择性肾小球性蛋白尿和混合性蛋白尿。可能这2类蛋白尿多见于DN的中晚期,同时结果可能受病例数和前期病例筛选的限制,其在早期DN的出现情况还有待于进一步观察。
限于检测灵敏度和受尿液离子基质等的影响,肾小管性尿蛋白在轻度异常范围内很难通过24 h尿微量总蛋白测定(染料结合法或比浊法)[ 5]检测出;而目前普遍用于早期DN筛选的24 h尿mAlb测定(放射免疫法)对肾小管性尿蛋白成份亦不具有特异性,只能在尿总蛋白排出量增大、尿白蛋白≥30 mg/24 h时才能引起临床关注;尿液特定蛋白测定(免疫比浊法)虽能特异分析肾小管性尿蛋白,但单项测定均有各自局限性而多项联合测定费用较高。同时,上述测定均未能反映尿蛋白谱全貌,可弥补这项不足的是尿蛋白电泳法[ 6, 7]。与肾活检相比,尿蛋白电泳可在无损伤的情况下协助临床判断肾病变的部位和程度。尿蛋白经电泳后以分子量不同而显带,中、高分子量蛋白主要反映肾小球病变,而低分子量蛋白代表肾小管和间质损害或溢出性改变。其中溢出性蛋白尿仅在小分子区出现少量深染条带,而肾小管性蛋白尿主要表现为多条低分子条带较为均匀出现,同时白蛋白比例不超过总蛋白的40%。这种多条带综合分析在早期DN肾小管性蛋白尿的监测中尤显优势。
以往研究[ 8, 9]多集中于对已确诊为DN的患者进尿蛋白电泳分析,而本研究的研究对象为无临床DN病史的DM患者。通过尿蛋白电泳分析,结果显示在排出微量和极微量白蛋白尿的DM患者中肾小管性蛋白尿占有相当比例(17%)。此类以肾小管损害为主的早期DN应引起临床重视。不同于前期文献[ 9, 10]使用尿蛋白定性法进行对比分析,本研究选择了敏感度较高的尿mAlb定量法过筛病例并观察尿蛋白电泳模式。结果显示在mAlb排出量仅1530 mg/24 h的病例中,通过尿蛋白电泳法尚可检出肾小管性蛋白尿2例,可见尿蛋白电泳结合mAlb检测可提高早期DN的检出。
总之,肾小管损伤在早期DN中占有相当比例,使用尿蛋白电泳结合尿mAlb检测可减少早期DN肾小管性蛋白尿的漏检。
参考文献
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