血清甘油三酯的测定方法与标准化研究进展

司徒凌楚

血清甘油三酯／三酰甘油(TG)是一项重要的临床血脂常规测定指标，特别是随着对其致动脉粥样硬化(AS)作用研究的深入，TG作为冠心病的一项独立危险因素日益受到重视。但是目前血清TG测定及其临床应用尚存在很多问题，如生物学变异、游离甘油对测定的影响、测定的标准化系统不完善等等。本综述仅对TG的生物化学、测定方法与标准化、临床意义等方面的近况作一简述。
一、TG的生物化学
      TG又称中性脂肪，由3分子脂肪酸和1分子甘油酯化而成，是体内能量的主要来源。TG处于脂蛋白的核心，在血中以脂蛋白形式运输。除TG，外周血中还存在甘油二酯、甘油一酯(两者总和不足TG的3％)和游离甘油(FG)。各种脂蛋白中，乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)及其残粒中TG含量高，统称为富含TG脂蛋白(TRL)，也称残粒样脂蛋白(RLP)。越来越多的临床与实验证据提示，TRL在病因学中扮演重要角色，可能作用于AS病变早期 。TG的代谢可分为外源性和内源性两条途径。外源性途径指食物中的TG在小肠内水解成脂肪酸和甘油一酯、二酯后由肠黏膜吸收入细胞，再合成TG并与其他脂质形成CM，通过淋巴系统入血。CM中的TG在脂蛋白脂酶(LPL)作用下水解为甘油和游离脂肪酸(FFA)，被细胞利用或贮存。高脂饮食后3～6 h，血液中CM相关的TG达到峰值，脂肪的吸收速度因食物中脂肪的成分及个体差异而不同。内源性代谢途径指CM水解产物——CM残粒以受体介导的形式被肝脏吸收，其衍生物和一些新组分合成VLDL。与CM水解类似，VLDL分泌到血液后被IJPL水解成残粒，其中部分直接被肝吸收、分解，另一部分继续水解形成中间密度脂蛋白(IDL)，最后生成LDL。VLDL的合成与水解受多种因素调节，包括底物利用率、激素状态、水解酶的活性及一些特殊载脂蛋白辅因子的活性。
二、TG测定的方法学
      血清TG测定方法一般可分为化学法、酶法和色谱法3大类。早期测定方法是以总脂质与胆固醇和磷脂之差估算。化学法用有机溶剂抽提标本中的TG，去除抽提液中磷脂等干扰物后，用碱水解(皂化)TG，以过碘酸氧化甘油生成甲醛，然后用显色反应测甲醛。比较准确的是二氯甲烷一硅酸．变色酸法(Van Handel—Caslson法)，此法抽提完全、能去除磷脂及甘油干扰、变色酸显色灵敏度高、显色稳定，至今还是美国疾病控制与预防中心(CDC)的内部参考方法。但因操作步骤繁多、技术要求高而不适于临床常规应用。核素稀释／气相色谱／质谱技术(ID／GC／MS)主要用作参考系统中决定性方法的建立及参考物质的制备与定值，此法费用昂贵，样品处理复杂，难以推广应用。
      目前几乎所有的临床实验室都用酶法检测血清TG水平，虽然方法各异，但一般都包括3个基本步骤：用最合适的LPL水解TG生成甘油和FFA；接着是转化，该步骤一般只用一种酶，例如甘油激酶，将甘油磷酸化以进行下一步反应，或者生成中间待测物；最后是有色染料(常为醌亚胺等)或者紫外吸收物质的形成，再通过分光光度法计算相应的TG浓度。如脂蛋白脂酶-甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法(GPO—PAP法)等。此法具有简便快速、微量、精密度高的优点，且特异性强，易于达到终点，线性范围宽。用一步法测定的是血清总甘油酯(定义为TG和FG及少量甘油二酯、甘油一酯之和，习惯统称为TG)。为了消除FG的干扰，中华医学会检验分会曾推荐GPO—PAP法的两步酶法作为血清TG常规测定方法”，该法不增加试剂成本和工作量，适合自动化分析，由于试剂分成两部分加入，对正确设置测定参数有较高要求。对此法能否去净游离甘油方面有人提出质疑。针对这一情况，近来中华医学会检验分会在《关于临床血脂测定的建议》文件中建议酶法如GPO—PAP法作为临床实验室测定血清TG的常规方法。普通临床常规实验室可采用一步GPO—PAP法，有条件的实验室(如三级以上医院)应考虑开展游离甘油的测定”。
      血清FG对TG测定结果的影响是临床十分关注的问题。国外资料显示，正常人体FG含量为0．06～0．22 mmol／L，约占总TG的6％ ～14％。国内结果与此相近，我国正常人 FG 水平平均约为0．08 mmol／L(0．02～0．33 mmol／L)，约占总TG 7．19％ (0．81％ ～21．64％)。虽然临床标本中FG显著升高者很少见，但有些异常或病理情况下如应激反应(肾上腺素激活LPL促进体内脂肪水解)，剧烈运动，服用含甘油的药物如硝酸甘油，静脉输入含甘油的营养液，肝素治疗，某些严重的糖尿病、肝病与肾病，取血器材或试管塞上带有甘油等时，可见血清FG显著升高，并给临床决策带来误导 。因此，可采取测定“真”TG的方法减少其影响：一种是同时测定总甘油和FG，两个结果的差值反应了真TG浓度(外空白法)，另一种是用上文所述的两步酶法直接测定TG(内空白法)。前者国内外应用较少，后者国外(如日本)使用较多，目前国内已有许多临床实验室开展。
      对于FG空白的设置建议采取如下措施：(1)临床实验室应备有可以做FG空白的检测系统，在任何情况下都可以做FG空白；(2)TG报告单中应标明是否为FG空白结果，实验室应告知临床医生FG空白的意义；(3)临床及基础研究、参加CDC脂质标准化计划的实验室都要做FG空白；(4)住院病人中内源性甘油过高群体的标本都应做FG空白；(5)体检及门诊患者可以不做FG空白，但糖尿病或其他特殊门诊例外；(6)FG>2．3 mmol／L者最好做FG空白；(7)对某些可疑情况。如TG高而血清不混浊应排除高FG的可能。一些物质如抗氧化物质(维生素c等)、黄疸、溶血、脂血等对酶法测定TG有干扰，可采用设置血清空白予以消除。
      在应用自动生化分析仪进行临床常规TG测定时。还要特别注意交叉污染和基质效应对测定的影响。最易对TG测定产生交叉污染的是总蛋白和铁试剂，因其还原物质浓度可影响Trinder反应。如果接着TG测定直接胆红素，也会因表面活性剂的导入产生误差。铁测定对TG的影响与亚铁氰化钾的量有关。此外，还要注意常规酶法测定TG对制备物的基质效应。Holani 等用24份新鲜血清为对照。对5份CAP制备的冻干血清及9份CDC冰冻混合血清进行了评价。以3种商品TG酶试剂测定，以CDC参考方法为对比方法，校正游离甘油后，2种商品试剂对CAP及CDC血清均无基质效应，另一种商品试剂对4份CAP血清有基质效应。也有资料表明，各种质控血清中FG占TG的12％—85％。近来我们的研究也发现，目前临床使用的各种TG检测试剂盒、不同的测定／校准系统、质控血清之间存在明显的基质效应，因此对于不同方法／试剂的选择，如选用两步酶法试剂和质控物时要注意其反应的通用性与适用性。
三、生物学变异和分析前变异对TG测定的影响
      TG测定的结果受取样时个体生物学变异(c )和分析不精密度(c )的影响 。一般情况下，c 相对较小(约为3％)，而c 占总变异的90％多。即使严格按美国胆固醇教育计划(NCEP)要求控制的个体，在2周内2次所测的TG结果差异百分比约为胆固醇的5倍，75％以上的个体在两周内的变异大于10％ 。李健斋等研究发现，我国人群血清TG个体间变异为28％ ，居所有血脂项目之首。国外资料表明，空腹2．5个月的人群TG变异约25％ ，非空腹状态的变异更大。日间约为6．3％—65％，月内为12．9％—34．8％ ，1年为12．9％—39．9％，以上数据均为正常个体稳定饮食状态的结果，某些病理状态下的波动会更大 。
      为减少上述变异对TG测定的影响，NECP建议受试者在两个月内分次测定，两次间至少间隔l周，测定结果取均值。但当血脂水平远离医学决定水平时，无需多次取样。标本采集要求受检者在前3周内不改变饮食习惯，采血前至少12 h不进食，72 h不饮酒。抽血后应尽快检测，某些含有高活性LPL的标本，如用肝素治疗的病人标本，TG常会过度水解 。标本最好放在冰浴中，2 h内分离血清。室温放置1dTG下降达34％ 。Eberly等发现非空腹高TG血症的发生明显多于空腹，而两种状态高TG血症所致冠心病的危险
基本相同，因此测非空腹TG更有利于冠心病危险预测。
      临床上常见到肉眼脂血标本，这常与一些潜在的错误有关。其中之一是LPL水解TG时产生的“清除效应”。在用血清而非试剂作空白时，大颗粒TRL散射引起假性高基线吸收。随着反应的进行，TG被水解，脂蛋白颗粒变小。浊度也减小，总的效应是在吸光度上升(产生NADH)的反应中，结果轻微偏低。这种误差所占比率较小，且只发生于高浓度TG标本中，其误差通常是可接受的。另外，肉眼脂血标本特别是CM含量过高者，由于CM漂到样品杯上层使标本成为多相。因此，对于肉眼脂血标本，应充分混匀且尽快
检测。TG水解产生大量脂肪酸，特别是脂血标本，由于其浊度和产物的抑制作用，对分析也有影响。在反应的缓冲液中加入牛血清白蛋白或 一环式糊精可以避免上述情况。
四、TG测定的标准化
      目前美国的TG测定的参考系统较为完善 ，其推荐的决定性方法是由美国国家标准与技术研究所(NIST)建立的ID／GC／MS法，以13C3 甘油三软脂酸酯为内标，可测总甘油酯和“净”TG，一级参考物质为NIST的SRM 1595(三软脂酸甘油酯)；参考方法为美国疾病预防和控制中心．国家心肺血液研究所(CDC)的二氯甲烷．硅酸-变色酸法，一直被用作美国CDC—NHLBI血脂标准化计划中的参考方法，该法用Supelco的三油酸酯和NIST的三软脂酸甘油酯标准物质SRM 1595的2：1混合物作标准，测定值不仅是TG，还包括(或部分包括)甘油二酯和甘油一酯。二级参考物质有NIST的SRM1951a、CAP RM026及CDC的多种冰冻血清。此参考方法步骤烦琐，实验室间进行方法学转移比较困难，目前CDC拟对其进行改进，以期在胆固醇参考方法实验室网络(CRMLN)建立一个结合提取、水解步骤的酶法作为“指定参考方法”。国内陈文祥等建立了高效液相色谱(HPLC)测定总甘油和游离甘油的方法，测定总甘油酯的相对不精密度小于2％ ，游离甘油小于4％，总甘油平均回收率100．0％ ，游离甘油99．7％ ，与ID／GC／MS法相对偏差不大于±2％。此法拟推荐作为我国TG测定的参考方法。
      血脂测定标准化并非要求统一测定方法，而是要求实验室测定结果达到所制定的技术目标。对于TG测定，目前国内外要求不精密度(用CV表示)应不大于5％ ，不准确度(用偏差表示)应不大于±5％ ，总误差应不大于15％。总误差=偏差％ +1．96 CV (与参考血清的靶值比较) 。特别值得一提的是卫生部北京老年医学研究所血脂实验室已于2002年3月被接纳CDC的CRMLN成员(全球共12
家)，在血脂测定的标准化方面积累了丰富的经验，我国TG测定的参考系统正在建立之中。
五、TG测定的临床意义
      测定血清TG水平主要用于了解机体内TG代谢状况、高甘油三酯血症诊断和评价冠心病危险、代谢综合征的诊断及应用Friedewald公式计算LDL-C水平等4方面目的”。其中应用Friedewald公式计算LDL—C 有3个前提条件，结果的可靠性也受TG浓度的影响，随着直接检测LDL—C的方法逐渐成熟，该公式应用越来越少。
      由于种族、饮食等的差异，各国的分类水平也不尽相同 。如荷兰认为理想的TG浓度为<1．1 mmol／L，在1．1—4．0 mmol／L范围内冠心病发生的危险增加，>4．0mmol／L危险下降，极度升高则息胰腺炎危险高度增加。土耳其的研究表明TG中等程度升高(即1．6～2．5 mmol／L)时冠心病危险增加。目前国内的划分标准为：合适TG水平≤1．69 mmol／L；>1．69  mmol／L为TG升高” 。NCEP成人治疗专家组第3次报告(ATPⅢ)将血清TG分为4个水平：>15．64 mmol／L为极高，2．2—5．63 mmol／L为升高，1．69～2．25 mmol／L为边缘性升高，<1．69  mmol／L为正常。ATP III 认为降低TG治疗比升高HDL—C更重要，将LDL加VLDL胆固醇的和[定义为非HDL胆固醇](TC—HDL-C)=作为高TG人群(≥2．26 mmol／L)治疗的第二靶标” 。
      TG增高主要见于家族性高甘油三酯血症、家族性混合性高脂血症、冠心病、AS、糖尿病、肾病综合征、甲减、胆道梗塞、糖原累积症、妊娠、口服避孕药、酗酒、急性胰腺炎(>11．3 nunol／L)。高甘油三酯血症是否为冠心病的独立危险因素?对于这一问题，以往学术界存在争议。一些研究发现，在单因素分析中，TG水平上升与冠心病危险呈正相关。TG升高常伴随高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低，经多因素分析修正HDL-C等其他危险因素后，TG与冠心病危险的相关性在许多情况下会减弱或消失。但近些年许多大规模流行病学和前瞻性研究分析显示，高TG也是冠心病的独立危险因素，提示一些富含甘油三酯脂蛋白(TRLs)被认为是致AS因素，TG和HDL-C一样，成为冠心病防治的目标之一。虽然继发性或遗传性因素可升高TG水平，但临床中大部分血清TG升高见于代谢综合征。鉴于TG和冠心病之间的关系，有必要对TG水平高低做出分类，为临床诊断治疗提供依据。
      虽然许多情况下TG水平升高对于心血管疾病的危险评估所起作用不如胆固醇，但高甘油三酯血症也是冠心病的独立危险因素，其对于代谢综合征的诊断具有重要的临床意义。特别是还需注意的是，极高浓度的TG还可以导致急性胰腺炎。因此，对于TG测定的方法学研究，尤其是建立适合我国国情的TG测定的参考系统，开展标准化工作，收集我国人群的TG资料，提出人群TG水平划分标准等是目前亟须解决的问题。
                                                                                                                                                  本文编辑：范伟伟