定量检验方法学的分析性能验证浅析

司徒凌楚

王青 女，1972年出生，遗传学硕士，医学实验中心常规检测实验室负责人、技术主管，多年来从事临检、生化、细胞遗传等专业检验工作，熟练掌握各项检验专业技术及ISO15189质量管理体系，具有较为扎实的医学检验及遗传学专业知识。
        依据卫生部《医疗机构临床实验室管理办法》第三十条款和CNAS-CL02：2008《医学实验室质量和能力认可准则》（IOS15189:2007）第5.5条款的相关要求，实验室应对方法学进行评价，以检查其分析性能和对预期用途的适用性。近年来，医学实验中心在实验室认可的工作中，进行了大量的性能验证试验，累积了较丰富的实践经验，本文从“5W+1H”六个方面，对定量检验方法学的性能验证进行汇总，供大家探讨和交流。
一、为什么要做性能验证？
        性能验证是为了确保实验室开展的检验项目，所应用的检测系统的分析性能或检验项目的方法学能够满足检测及临床要求，从而保证患者标本检测结果准确可靠。
二、进行性能验证的场所？
        按照实验室管理办法和认可准则的要求，医疗机构临床实验室应承担所开展检验项目的性能验证工作。
三、何时需要做性能验证？
        1、以下情况应完成初次性能验证：新安装的仪器拟开展的项目；新开展项目；同一项目的试剂变更厂家或检验方法发生变更时；仪器校准、发生故障维修后或更换主要的配件后，可能对结果产生较大的影响时，可选择其所开展的部分检验项目进行分析性能证。
        2、何时需要做性能评估/评价?
        初次验证后，对精密度、正确度及可报告范围等性能参数至少每12个月进行一次评估，可通过评估如CV、均值等室内质控数据的变化趋势（批间精密度）、室间质评项目的结果的可接受性（正确度）、临床医护人员对结果的反馈（可报告范围）、小样本的验证等多种方式进行。若评估的结果不可接受，则需重新进行性能验证。
四、哪些人员可以进行性能验证试验?
        性能验证试验应由实验室有资质的检验人员完成，必要时可由技术支持人员协助完成试验；而性能验证报告必须由资深的检验人员完成，并经科室主任审核后归档保存。
五、性能验证包括哪些方面？
        定量项目性能验证的内容包括但不限于：精密度（批内、批间）；正确度；检测低限（灵敏度）；携带污染率；线性范围；可报告范围；生物参考区间；检验结果量值溯源；测量不确定度；等。
六、如何实施性能验证？
1、性能验证试验的准备工作
        1.1 范围、材料、方案：应确定定量检测的项目；所需的仪器、配套试剂、校准品、质控品等材料；制定完整的性能验证方案（尤其是各项性能参数的判断标准的制定及其依据）。
        1.2 试验要求：仪器应进行校准或保养；要尽可能在相同条件下进行各项试验；所有试验均需在室内质控结果在控的情况下方可进行。
2、性能验证试验
        主要讨论精密度、正确度、携带污染率、线性范围、可报告范围的试验方法。
2.1 精密度
主要包括批内精密度和批间精密度两项
2.1.1 批内精密度
        标本选择：选择低、中、高三个浓度或中、高两个浓度的新鲜标本/质控品；
        试验方法：连续重复测定20/21次；
        结果计算：计算后20次检测结果的SD和CV；
        判断标准：以能力验证/室间质评评价界限作为允许总误差（TEa），批内精密度<1/4TEa；或者符合试剂说明书的要求。
        注意事项：若选择标本，则其浓度应尽可能接近质控品或试剂说明书中评价该性能所提供的标本浓度。
2.1.2  批间精密度
        标本选择：选择低、中、高三个浓度或中、高两个浓度的新鲜标本/质控品；
        试验方法：每天1次测试，连续测试20天；或每天2次测试，连续测试10天；或每天4次测试，连续测定5天;  
        结果计算：剔除离群值后，计算20次检测结果的SD和CV；
        判断标准：<1/3TEa；或者符合试剂说明书的要求。
        注意事项：若选择标本，首先应考虑检测物的稳定性，浓度要求同批内精密度；若检测物不稳定，则必须使用质控品进行该试验。
2.2  正确度
        可采用以下七种方法进行正确度评价：
        ①分析已知值的参考物质：因实验室不易得到参考物质，较少使用。
        ②分析厂商或第三方提供的已经赋值的质控品：因采用质控品进行正确度评价，尚存在争议，较少使用。
        ③加样回收试验：因大部分用于临床诊断的检验项目为微量或痕量物质，试验难度较大；不宜采用。
        ④方法学比对试验；适用于引进新方法时，可以与原有的方法进行比较，最少分析20个新鲜标本，要求浓度覆盖线性范围，用两种方法同时测定同样的样品（偏倚<1/2Tea），进行相关回归分析。
        ⑤分割样本室间比对：要求与使用相同检测方法的、质量保证措施较好的、或已获认可或的实验室，或与使用配套分析系统的实验室进行比对，结果满意。
        ⑥分析室间质评物：最为常用。检测卫生部临检中心质评物，检测结果均在允许范围内。
        ⑦分析厂商提供的参考物质：当以上六种方法均难以实施时，此方法最为实用。选择使用A、B两个不同批号校准品，使用A批号校准品进行校准，对B批号的校准品进行检测，连续测定6次，排除第1次的分析结果，计算其余5次检测结果的平均值，要求每次检测结果和均值都在校准品定值可接受范围内；并计算检测均值与厂家赋值的偏倚，以B（厂家提供的校准品B类不确定度）作为评价标准。
2.3 携带污染率（加样针）
        标本选择：取高浓度室内质控品或高浓度新鲜标本，混合均匀后放置于1、2、3杯位置，再取去离子水或生理盐水放置于4、5、6杯位置；
        试验方法：对以上6份标本连续进行检测，测定值分别为H1、H2、H3、L1、L2、L3；
        结果计算：携带污染率 =（L1－L3）×100% /（H3－L3）；
        判断标准：生化检验项目 <2%。
2.4 线性评价
        标本选择：选取接近线性范围上限的高值标本与接近下限的低值标本；无法获取合适的标本可使用添加物或校准品；上述条件均无法满足时，可选用满足临床需求的高值标本。
        试验方法：标本分别按5：0（100%）、4：1（80%）、3：2（60%）、2：3（40%）、1：4（20%）、0：5（0%）的比例进行稀释，每个稀释度重复测定3次计算均值。
        结果计算：将实测值与理论值作比较（偏离应小于10%），计算Y= bX + a，验证线性范围。
        判断标准：b在0.97～1.03范围内，a接近于0。
2.5 可报告范围
        适用于实验室开展的线性范围不能满足临床标本检测结果需求的定量检验项目。
        标本选择：取一份接近线性范围高限值浓度的病人标本，用去离子水、生理盐水、低值血清或厂商推荐的稀释液进行系列稀释，稀释比例参照厂商提供的机内稀释倍数。
        试验方法：每个浓度重复测定2次计算均值。
        结果计算：每个浓度实际测定的均值和稀释后的理论估计值，两者进行差值相对百分数计算，如果结果≤20%，此稀释度为技术上的可接受限。
        可报告范围的高限=可接受最大稀释倍数×线性范围（AMR）上限值；
        可报告范围的低限：线性范围的检测低限或功能灵敏度为可报告范围的低限。  
        综上所述，方法学的分析性能验证包涵许多的内容、技术要求较高，在实际工作中，应根据具体情况进行分析，在质量体系允许的范围内，选择合适的试验方法完成此项工作，保留原始数据，结合制定的判断标准，综合分析试验结果，以评价所选的方法学能否满足临床实验的要求，从而保障检验结果的准确性。
                                                                                     编辑：范伟伟