基因组医学及临床质谱检测

山泉

姚志建
        2003年生物医学领域的一件大事就是完成了人类基因组的全图。通过全世界科学家的努力，对携带了20000-23000个基因的人类遗传物质-细胞中的脱氧核糖核酸（DNA）的一级结构有了几近完美的解析。如果我们回忆自从孟德尔（Gregor Johann Mendel）揭示生命遗传奥秘的开创性贡献在20世纪初被重新发现以后，在整个20世纪基本上每隔25年就会呈现一波划时代的进展，这包括以摩尔根（Thomas Hunt Morgan）牵头的细胞遗传学的发现、DNA双螺旋结构的阐明（Francis Harry Compton Crick 和James Dewey Watson）、20世纪70年代前后一批有关分子克隆技术和遗传密码的发现、及上世纪末世纪初完成的人类全基因组测序。在进入21世纪后，对人类遗传奥秘的研究仍在高速持续，DNA测序技术在取得数量级的提高以后已经完全进入新的一代（New Generation Sequencing， 简称NGS）；一些国际合作的大课题取得重要的研究结果，例如人类单体型、1000例人类全基因组测序、肿瘤基因组全测序等等。与此同时，由基因组学延伸出来的蛋白质组学、代谢组学等也开始展现出一些有意义的成果。这些围绕人类遗传学的研究结果已经愈来愈深入的渗透到医学中，使临床医学有了一个新的层面-基因组医学。
        基因组医学的基础是利用基因组解析所得到的信息。日益增长的基因组学分析数据验证了一项早已预计到的事实---人类每个个体间的基因组组成是十分相似又略有差别。但是人与人之间基因组内这点些微的差别却往往与疾病有所关联，每个人有来自于遗传的不同的患病风险，因此检测这些细微的差别就在疾病的防、诊、治中具有作用。由于这些差别是细微的，因此需要很准确的分析，质谱做为一项准确、快速、高通量和自动化程度高的分析技术，将在这类分析中扮演重要的角色。 以下的讨论分为两个方面：一是基因分型，二是表型分型。基因分型谈的是分析基因组中核苷酸排列的些微差别，往往涉及到对等位基因的分析，不同的等位基因往往涉及到不同的疾病关联。表型分型指的是由于基因组编码的差别所造成的下游产物结构上的不同，主要是蛋白质。文中讨论的着重是与临床检验相关的内容。
  
一、基因分型
        人类的遗传密码，也就是它的大约23000基因中核苷酸在聚脱氧核糖核酸（DNA）中的排列，这种排列的绝大多数在人与人之间都是一致的，但也有细微的变化，这种变化会发生在一定的排列位置上而被称为等位基因，等位基因的存在带来人与人之间的差别（称作遗传多态性）。一个大家熟知的例子就是器官移植中的配型，配型就是要在人群中寻找在DNA的细微差别上与接收移植者尽可能一致的供方。
        疾病是能遗传的，这类遗传有两种。一种称为“单基因病”，指父母在一个基因上有所改变就可能被遗传给后代，这类病有上千种，但大多数发病率不高，公众比较容易知道的大约是链状细胞贫血，这类疾病已经被认识和研究有许多年了。另一种称为“多基因病”，这类病的遗传并非源于一个基因而是涉及到多个基因，每个基因对病的发生有一定贡献，多个基因的作用综合起来并加上环境的影响才会出现疾病，这类病都是重要的常见病，例如糖尿病、高血压等，对这些病的遗传学研究最近几年由于技术的进步才有可能，又由于这类病的发生和发展在一定程度上是可以人为干预的，因此是当今医学研究的热点，也是质谱分析最有用武之地的领域。
        图一以两种微变异为例显示核苷酸序列的改变，图中SNP指的是单核苷酸多态性，STR指的是短片段串联重复多态性。

        用质谱测定单核苷酸多态性（SNP）具有准确、高通量和性价比高的特点，可以说是SNP测定技术中的金标准，其基础是取来自于每种核苷酸分子量的差别(表一）。

        设法测出在每个等位基因位点上到底出现的是哪一种等位基因（对SNP来讲就是在该位点上出现的是哪一个核苷酸，对STR来说就是存在几个串联短片段），对疾病的防治往往有重要的意义，下面分三个方面介绍。
        （1）个性化用药：每个人对同一种药物的反应是有区别的，这取决于每个人对某种药的敏感程度、药物在该位病人体内代谢的快慢及是否容易出现副作用等。这在相当程度上都是与遗传相关的。 根据美国FDA的看法，他们已建议药厂在大约145种药物标签上注明基因组学的生物标志以供医生在用药时可以加以考虑。在这些生物标志中包括常染色体上基因的多态性、表达谱的改变、功能性缺陷、染色体异常等，这其中相当一部分可以用质谱来进行检测，表二列出了截至到2014年3月份所建议给以标示药物在各科用药中的分布。

        表中的数据显示在抗肿瘤药物中建议加以标示的药物种类最多，这自然与该组疾病的严重程度、发病的频率及用药的成本直接相关。对一位不幸患了恶性肿瘤的患者，尽快给予最有效的药物是十分重要的，同时在使用一些十分昂贵的药物时更必需考虑对这位病人是否合适。在用药之前做一次基因组医学的检查应该是十分有益的。给药物加以基因组学生物标志的建议是一张增长很快的表格，在2012年时，表中列出的药物还只是大约70种，两年的时间就大约增长了一倍。
        （2）个性化治疗：个性化用药其实就是个性化治疗的一部分，个性化治疗还可以包括更多的内容，比如追踪在治疗过程中出现的基因组的变异。这其中一个重要的进展就是测定病人血中参杂的少量肿瘤细胞或属于肿瘤释出的游离DNA。
        肿瘤治疗中往往会发现在治疗的进程中出现对药物的抗性而丧失疗效，例如在晚期非小细胞肺癌的治疗中所选用的危洛替尼（Erlotinib，Tarceva，特罗凯）、吉非替尼（Gefitinib、易瑞沙），药物的作用来源于对EGFR有基因变异的病人能通过关闭肿瘤细胞偏爱的信号通道而杀死癌细胞，但是这些药物的作用随着治疗的进程可能会出现疗效丢失。丢失的发生有数种原因，但其中最多见的一种是由于在EGFR基因上再次发生变异，使其编码蛋白的第790（T790M）位上发生了一个氨基酸的改变，由酪氨酸变成甲硫氨酸。与此相类似的影响疗效的再次变异还有一些，例如慢性髓性白血病中发生的ABL T315I、胃肠基质瘤时的 KIT T670I、腺肉瘤中的ALK L1196M等。
        用药前检查病人是否存在适于用药的基因突变及随后在治疗过程中追踪是否又发生再次的突变都可以用质谱来进行检测，初始的检查可以通过检测肿瘤组织来实现，但几乎不可能在随后的治疗追踪中不断地得到实时的肿瘤组织，因此需要一种灵敏、准确的方法来追踪给药病人血样中存在的肿瘤DNA或肿瘤细胞。使用单等位基因碱基延伸法（Single Allele Base Extension Reaction, SABER）配合MALDI-TOF质谱可灵敏、准确地测定出病人血液中循环肿瘤DNA再次发生的变异，据称当血中循环DNA达到低于0.5%时就可以测出。
        （3）疾病风险预测：许多疾病与遗传都有一定的关系。上文已经提到过“单基因病”和“多基因病”的区别，风险预测针对的病种多基因病。多基因病是否发病取决于多个基因及环境因素的合力。这些所谓“微效基因”的与疾病相关的基因位点的成功发现大多来自一项被称为“全基因组关联分析”（ Genome-Wide Association Study，GWAS）的研究结果。由于多基因病大多涉及到发病率高的重要疾病，如肿瘤、心血管疾病、糖尿病等，因此很快就受到更为广泛的关注。
        关联研究中所使用的最为普遍的标志物是基因组中单个核苷酸的多态性（在一个位置上出现不同的核苷酸，简称SNP），对基因多态性的测定我们称其为基因分型，由于每种核苷酸的分子量都是各不相同的，质谱自然就成为准确而又性价比高的分型方法，可以说是目前此类分析的金标准。（图三为质谱法进行SNP分型的流程）。

        疾病风险预测对于个性化的管理自己的健康肯定是有利的，但其测定结果只是一项分析而并非诊断。随着GWAS研究的不断前进和积累，分析结果将愈来愈增加预测的准确性，从而不断加强个性化管理健康的能力。美国基因组研究所的科学家在年曾对GWAS所得结果与其在风险预测中的意义做过一个计算，可能会对我们了解这项测定的意义有所帮助（表三）。

        由表中可以看到，位点之间有较大的差别，有些性状位点不多但影响明显，另一些则虽然位点很多，但预测的能力很低，因此在风险预测中对测定位点组合的设计意义关键。
  
二、表型分析
        “基因组学”的含义是指全面研究和分析携带某一物种遗传信息的DNA的整个组合。自“基因组学”的研究在近年来取得很大成功的启示下，一系列“组学”的概念被提出并获得重视，如转录组学、蛋白质组学、代谢组学等，将这些“组学”的结果应用于临床应该也是基因组医学的一部分，由于这些“组”都处于基因组下游，其表现都是性状（表型）的差异，对它们的分析属于表型分析。在各种“组学”中蛋白质组学的发展与质谱技术的进步关系最为密切，其与临床相关的成果易于延伸为质谱的临床应用。
（1） 生物标志物的靶向质谱分析
        在像血液这类复杂的样品中存在着上千种不同的蛋白质，这些蛋白质酶解为多肽后形成数量更多的信号，蛋白质组的全面分析需处理海量的数据，目前并不适用于临床实验室的日常检测。而靶向质谱分析则与此相反，它的分析对象是直接针对某些对临床诊断、治疗、预后有重要意义的特定分子，可以直接用于日常的医学检验之中。
        靶向分析在串联质谱中进行。所谓串联质谱是指有多级质谱串联，可以同时分析某一化合物的母离子和进一步解离后产生的子离子的质谱技术。临床化学家根据分子病理学的知识及最新研究结果列出靶分子，通过分子结构选用其母离子及最有特征性的子离子，定出待分析的跃迁离子对，使用质谱的多元反应检测（Multiple Reaction Monitoring, MRM）检测设定跃迁离子对（Transition），从而测定出该靶分子的存在。如果将标有稳定同位素的靶分子引入测定操作，能进一步大大提高测定的可信度并进行定量。更有意义的是一次质谱测定中可以同时测定多对跃迁离子，这样就能完成同时检测多个靶标分子的任务。
        从特异性地测定靶分子的角度看，MRM与免疫测定中经常使用的酶联法（ELISA）十分相似，但MRM还具有一些重要的优点，见表四。

        因此随着质谱技术在临床实验室的进一步普及，应该会有愈来愈大的趋势以MRM取代ELISA。表五列举了一些经美国FDA批准可用于临床的肿瘤标志物，大多存在以质谱法取代现有的免疫测定法的可能性。

        在现今投入大量资源的蛋白质组的研究中，寻找各种疾病的蛋白标志物是为数众多课题的方向，也发表了许多这一研究方向的结果，虽然从实验室各自的发现到成为一种公认的疾病标志还需要多个实验室的复捡和认定，但一批有临床意的新的疾病标志物还是可以期待的。
（2）质谱分析蛋白质表达特征鉴定细菌和其他微生物
        理想的微生物鉴定方法应该是准确、快速和性价比合理。从显微镜被发现和制造成功后，病原微生物鉴定一直就是医学诊断的重要助手，在此期间经历了从形态、生化代谢、基因组特异性等方法的延续发展，直到最近出现的蛋白质表达特征的质谱分析，代表了科学家对理想微生物鉴定方法的追求。
        每一种微生物的蛋白质组成都是有差别的，特别是丰度高、特征性变化多的核糖核蛋白体，实际上在基因组的水平上，编码核糖核蛋白体的基因序列就被用于细菌鉴定。用质谱分析鉴定微生物最早的报告出现在1975年，但当时还未研制出适用于生物大分子的质谱，因此分析的对象是脂类。上世纪80年代后期适用于大分子的电喷雾质谱(ESI)激光解吸电离飞行时间质谱（MALD-TOF）问世，90年代质谱鉴定微生物的研究就有了长足的进展。到了21世纪开始有商品化的专用仪器上市，2013年8月美国FDA批准了第一台专用质谱用于医学检验，大约3个月后又批准了另一品牌的仪器，可以说自此质谱分析蛋白质表达特征鉴定病原微生物开始正式进入了临床医学领域。
  
结语：
        纵观基因组医学的发展，有三项技术是与它密切相关的，即DNA测序、定量PCR（qPCR）和质谱。它们各有特点，会起到相辅相成的作用。DNA测序由于新一代测序技术（Next Generation Sequencing, NGS）的出现而成为一种高通量、性价比日益提高的技术平台，但目前除了无创筛查胎儿染色体异常外，基本上还是一项以研究为主的平台。qPCR对单个或数个基因位点的检测是十分有效的，研发专用的试剂盒也比较容易，加上许多医院都已经配置了相关的仪器而有利于推广，但qPCR并不利于大量靶点的同时测定。质谱的特点是可以进行高通量、多靶点的同时测定，不仅可以做基因分型还可以做表型分析，有利于将“组学”的研究结果直接推广到临床。质谱目前正以很快的速度进入临床实验室，不容质疑会扮演愈来愈重要的角色。
                                                                                         编辑：范伟伟

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