中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白（NGAL）临床应用研究进展 ...

老三

       中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白（NGAL）1993年于中性粒细胞内的过氧化物酶颗粒中被发现。生理条件下少量合成于骨髓中性粒细胞的中幼及晚幼阶段，炎症反应和恶性肿瘤可诱使其在多组织（如子宫、前列腺、唾液腺、肺、肾、气道及消化道上皮等）中大量生成。NGAL因其在急、慢性肾脏疾病中的生物学预警作用受到重视，近年来，其在心脑血管疾病，糖尿病等领域的研究也逐渐展开，本研究就NGAL的结构、生物学特性及临床应用研究等进展做一综述。
一、NGAL的结构
       NGAL的cDNA及全基因序列分别于1994年和1997年被克隆，位于染色体9q34的NGAL为单拷贝基因，其cDNA全长为5869 bp，包括1695 bp的5'端调控区、178 bp的3'端非转录区及3696 bp的原初转录区，后者由7个外显子和6个内含子构成。NGAL 5'端可与CTF/CBP、造血转录因子、GATA-1和NF-KB结合；而距起始密码子ATC上游66bp和69 bp处分别有A和G2个转录起始位点，推测可能参与基因的表达调控。同源分析提示NGAL与小鼠癌基因24p3 cDNA全序列同源性为71.3%；其在大鼠的同源基因为neu相关lipocalin（neu-related lipocalin， NRL）。
       作为分泌型蛋白，NGAL的相对分子质量约为25 000；含198个氨基酸残基，包括N端由20个氨基酸组成的信号肽序列及其后含178个氨基酸残基的肽段，等电点为8.40。与脂质运载蛋白家族其他成员类似，NGAL蛋白具有一个保守的三级结构，即由8段反平行式β-折叠构成的β-折叠桶结构，其间的连接环由一个Ω环和7个典型的β-发夹结构构成，第4、5环上的游离巯基可与基质金属蛋白酶-9（MMP-9）前体（pro-MMP-9）以二硫键结合；折叠桶底部内侧则由疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基形成疏水核，结合并运输亲脂性配体如白三烯B4等；NCAL蛋白N端为310-螺旋封闭，C端则由α-螺旋组成，为开放端，可与配体结合。该蛋白成熟体可以单体、同源二聚体或与MMP-9形成异源二聚体3种形式存在。明确NGAL蛋白的空间结构有助于进一步开展功能研究。
二、NGAL的生物学特性
       生理状态下，除中性粒细胞外，NCAL少量表达于多个系统的上皮细胞，包括呼吸系统支气管上皮单个黏液细胞；消化系统的胃壁细胞、小肠部分潘氏细胞；泌尿生殖系统的肾小管、前列腺上皮细胞、尿道伞部细胞、乳腺上皮细胞；以及免疫系统的胸腺上皮细胞、淋巴结单个滤泡中心细胞等。但在脑细胞、周围神经细胞、心脏等组织细胞中并无表达。
       NGAL蛋白通过受体介导的内吞作用人胞，其β-折叠桶结构可结合并运输铁离子，已知NGAL可以单体形式结合并转运铁离子出胞，也可以NGAL-铁复合物形式转铁人胞；NGAL入胞后一方面竞争性抑制细菌的铁摄取，另一方面与细菌来源趋化物N-甲酰基蛋亮苯丙肽结合，促进细胞释放趋化因子、白介素，对炎症反应起负反馈作用，参与体内的炎症反应；同时NGAL-铁离子复合物可减轻缺血再灌注损伤中的氧化应激损伤，保护肾组织；NGAL也能通过稳定细胞极性；增强细胞抗凋亡能力，减轻组织损伤，参与肿瘤的发病及转移；有关NGAL生物学功能的具体机制及其与疾病的关系详细阐述见下。
三、NGAL的临床应用及机制
       1.NGAL与肿瘤性疾病：NGAL在肿瘤中有明确的组织特异性：其在乳腺癌、结肠腺癌、卵巢癌等肿瘤中表达上调；而在胸腺肿瘤、肾癌和前列腺癌则下降。即使在同一肿瘤组织，如肺癌及胰腺癌的不同亚型中NGAL表达也从阴性到强阳性不等。
       肿瘤发病：NGAL升高可下调E一钙黏蛋白表达，引发肿瘤细胞骨架重组，增强细胞与基质之间的黏附，诱导上皮一间质转化发生；而其基因中-152-60区段的TPA反应元件，可诱导人永生化食管上皮细胞SHEE恶变，沉默NGAL基因可使细胞形态及细胞间连接恢复，食管上皮细胞恶性消失，提示NGAL可能作为一个癌基因在食管癌的发生中起重要作用。
       肿瘤增殖：NGAL在胚胎期即可发挥生长因子相关的作用，促进细胞增殖；给予外源性NGAL蛋白可使甲状腺癌细胞集落形成能力增强；上调NGAL蛋白表达可保护肿瘤细胞免受特定凋亡诱导因子诱导的细胞凋亡，增强肺腺癌细胞，白血病及甲状腺癌细胞的抗凋亡能力；但存胰腺癌细胞中，NGAL的改变与细胞行为无关；同样在食道癌细胞中，NGAL基因水平下调并不影响端粒酶活性。
       肿瘤转移：MMP-9通过降解细胞外基质促进肿瘤细胞转移、浸润；NGAL与MMP-9以二硫键形成复合物后，通过抵消组织金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）对MMP-9活性的抑制作用，延长MMP的蛋白水解活性，促进其降解细胞基底膜，进而介导肿瘤细胞浸润、转移；而NGAL通过摄取铁离子促进细胞增殖也有助于肿瘤细胞生长浸润；来自不同实验室的数据显示NGAL水平与乳腺癌、胃癌、直肠癌及食道癌等的侵袭能力、淋巴结转移能力、癌细胞浸润深度等高度相关：但在结肠癌中呈负相关。
       NCAL参与了肿瘤的发生、增殖、侵袭，且在其中表现出明确的组织特异性，因此，探讨NGAL在肿瘤疾病中的作用有助于理解肿瘤疾病复杂的发病机制，并将其转化至应用层面。
       2001年首次有人指出NGAL可引起消耗综合征，与肿瘤恶病质相关，随证据积累，NGAL已成为恶病质患者预后不良的独立预测因子，该作用机制的深入研究有助于寻找肿瘤终末期姑息治疗的靶点。
       2.NGAL与心脑血管疾病：体内实验发现，活性氧簇（ROS）刺激后小鼠各脏器及斑块内NGAL水平上调，并可被抗氧化剂抑制，提示ROS参与动脉粥样斑块的形成，NGAL可通过清除ROS保护细胞免受损伤；但血管平滑肌细胞在体外培养时，又可见内膜和中膜平滑肌均表达NGAL、MMP-9，后者与血管重塑、动脉粥样硬化和斑块破裂有关，血管损伤后两者的表达水平同时上调，推测NGAL/MMP-9复合物的增加是斑块不稳定的主要原因之一；已知脂肪、肺组织是肥胖状态下NGAL升高的主要来源，由此发现NGAL与肥胖相关代谢综合征的一些因素如血脂异常，胰岛素抵抗等相关，后者可诱发异常脂蛋白血症，影响血管壁细胞的能量代谢，促进动脉粥样硬化形成；且NGAL在动脉粥样硬化斑块相关疾病如心肌梗死、急性动脉粥样硬化性脑血管病中的表达均升高，推论NGAL与动脉粥样硬化疾病发生发展相关，但具体机制未明。此外，NGAL在心脏移植中调节缺血一再灌注的免疫损伤，有报道指出NGAL还可能参与心脏移植后炎症的调节作用。
       NGAL与心血管疾病的关系研究刚刚起步，争议颇多，其参与炎症负调节的免疫功能对疾病起保护作用，但随着炎症状态的持续，NGAL/MMP-9复合物表达增加又推动疾病进展，因此其在疾病中的功能及意义期待更多的研究证实。
       3.NCAL与呼吸系统疾病：慢性阻塞性肺病（COPD）是一种呈慢性进展并以气道不完全可逆的气流受限为特征的肺部疾病，中性粒细胞和肥大细胞释放的蛋白水解酶MMPs对肺组织的破坏推动了疾病进展，两项不同的研究显示：CT确诊的肺气肿患者，其血清及支气管肺泡灌洗液中NGAL水平显著升高，推断NGAL的显著增高与MMP-9免疫反应性增高相关联。气道高反应性疾病中检测痰及血清NGAL水平上调，并证实是受循环血液中NO刺激所致，其机制尚不明确。
       4.NGAL与肾脏疾病：NGAL在肾脏病领域最早被作为急性肾损伤（AKI）新的早期诊断标志物提出，近年来发现慢性肾脏病（CKD）、继发性肾脏病中NGAL同样具有诊断及预警意义。
       （1）AKI：正常情况下NGAL在肾组织少量表达，缺血.再灌注肾损伤动物模型中血、尿NCAL分别上升300倍和1000倍。针对儿童心脏手术的研究显示并发AKI者术后2h尿NCAL浓度明显升高，远早于1-3 d后才出现改变的血清肌酐，敏感性可达82%，特异性为90%；而术后12 h尿NGAL水平则与AKI的病死率明显相关；成年患者心脏手术后2h尿NGAL同样可作为AKI的早期诊断指标，并与其发病率及体外循环持续时间明显相关，但该相关性较儿童低，考虑可能与受试人群基础疾病状态等因素相关。在肾移植手术中，尿及肾组织中的NGAL高表达均与术后肾功能延迟恢复（DGF）相关，尿NCAL每上升100 μg/L，DGF风险相应上升20%；而血清NGAL的改变则有助于判断患者是否需要透析治疗。
       注射造影剂后2 h血、尿NGAL诊断AKI发生的敏感性为73%，特异性为100%，且造影剂剂量与疾病发生无明显相关性。但针对143例全身炎症反应综合征患者的研究指出，入院24 h血NGAL检测选取临界值139 μg/L时，判断AKI的敏感性为86%，特异性仅为39%；不能作为AKI诊断依据，可能与脓毒症全身炎症反应而并发AKI机制不同有关。
       此外，NGAL被指出通过诱导损伤后的近端小管上皮细胞血红素加氧酶-1（Hemeoxygenase-1，HO-1）及N-钙黏蛋白高表达，起到保护肾功能的作用，同时参与小管上皮细胞的修复过程，但因缺乏进一步实验依据，尚未能应用至临床。
       （2）CKD：肾纤维化是指正常肾组织被细胞外基质所取代，伴肾功能进行性不可逆性损害的过程，最终致CKD发生。越来越多的证据证实NGAL参与其中：机制涉及NGAL引起Ras诱导的下游信号蛋白磷酸化消失，影响Ras-MAPK通路；MMP-9活性上调促进肾脏纤维化发生等方面。而NGAL的反式作用因子cAMP反应序列结合蛋白活化后可降低上皮细胞的黏附性能，产生同样结果。一项针对45例CKD 2～4期患者的分析研究表明，与传统的小球损伤标志物胱抑素C相比，进入CKD 3期以上的患者，NGAL与疾病的相关性更高，且可作为疾病进展的独立预测因子。
       （3）糖尿病肾病：2007年Wang等发现，在糖尿病或肥胖小鼠体内，NGAL可在脂肪组织、肝脏大量表达，远高于对照组。同期的临床验证显示，NGAL与肥胖、高脂血症、高血糖、胰岛素抵抗呈正相关（P＜0.05），与HDL水平呈负相关。接受罗格列酮治疗后NGAL明显下降。由此推论NGAL是肥胖及其相关代谢疾病的炎性标记物，并参与2型糖尿病发生发展过程，而现有糖尿病肾病诊断依据尿微量白蛋白，与之相比，NGAL升高可明显提前，并与肾功能进展呈正相关，拟成为2型糖尿病的预警标志物。
       （4）其他：生理状态下NGAL经肾小球滤过，大部分被近端小管重吸收，尿中基本不可见。因此检测尿NGAL水平可判断肾小管重吸收功能，有研究证明在肾病综合征或间质性肾炎患者，尿NCAL水平可用于监测治疗效果。而在常染色体显性多囊肾中，NGAL可评估肾脏病变程度。
四、结语及展望
       综上所述，NGAL参与了多种疾病的发生发展，但许多功能及机制均需进一步明确；无论如何，NGAL在疾病中的重要性已获得大家的重视，通过与同类型疾病对比，基于先进的研究手段，NGAL在疾病发生发展中的分子机制会得以阐明，这不仅有助于在基因分子水平上深化对疾病机制的认识，也有助于将NGAL转化为各种疾病临床诊断及治疗的新靶点。
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