抗氨基甲酰蛋白抗体的研究进展

财小弟

作者：张鑫，李小峰，罗静
单位：山西医科大学第二医院风湿免疫科

氨基甲酰化是非酶的转录后修饰，氰酸根结合到包含伯胺或硫醇基团的分子上形成氨基甲酰化形式。这一反应改变了蛋白的结构和功能，从而引起一系列病理生理改变。在体内氰酸盐与尿素水平保持平衡，氨基甲酰化水平增加首先在肾病等尿素水平高的患者体内发现。随后，在心血管等其他疾病中也发现氨基甲酰化与炎症相关。最新研究发现它可以诱导自身免疫反应。在RA、有早期RA症状以及关节痛的患者体内发现抗氨基甲酰蛋白（carbamylated proteins，CarP）抗体。目前尚不明确氨基甲酰化程度和（或）氨基甲酰蛋白的形成对RA、肾脏疾病和心血管疾病等慢性病病程的影响。这篇综述总结了目前关于氨基甲酰化和抗氨基甲酰蛋白抗体形成的最新研究，并讨论它们可能产生的重要影响。

1　氨基甲酰化

1.1　氨基甲酰化的化学性质

氨基甲酰化是指"氨基甲酰"（-CONH2）的一部分与蛋白或氨基酸的功能基团结合。这个反应主要源于氰酸盐与蛋白之间的相互反应，尽管氨基甲酰磷酸盐也是氨基甲酰化的代表之一。在体外，氰酸盐能与氨基、硫醇基、羧基或苯酚反应，但不能与羟基反应。氰酸根结合到氨基或硫醇基分别被命名为N-氨基甲酰化或S-氨基甲酰化。硫醇基、苯酚与氰酸盐的反应性最强，但这是一个可逆反应，限制其对蛋白质功能的影响。相比之下，蛋白质与氰酸盐发生不可逆反应，由于氨基的pKa较低，其反应速度比赖氨酸侧链快1 000倍[1]。除赖氨酸外，精氨酸、半胱氨酸的侧链也可与氰酸盐反应。

1.2　氰酸根的来源

尿素的自发性退化是氰酸盐的来源之一，它在人体中不断产生、无处不在，并与氰酸盐保持平衡，其平衡比在1~500 000。在肾功能障碍和血清尿素氮水平升高的患者中氨基甲酰化水平升高。除肾功能不全外，炎症是另一个可以刺激氨基甲酰化水平升高的因素。Wang等[2]、Holzer等[3]证明炎症可以通过髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）系统增加氨基甲酰化水平。髓过氧化物酶主要存储在中性粒细胞的颗粒中，它以过氧化氢和硫代氰酸盐作为底物生成氰酸盐。硫代氰酸盐来自饮食或吸烟等，可以分解为氰酸盐和其他离子。另外髓过氧化物酶也可以催化过氧化氢和氯化物之间的反应导致氰酸盐水平增加。在炎症中MPO水平显著增加，从而刺激氰酸盐形成[3]。这些发现表明，炎症刺激中性粒细胞释放MPO，能进一步增加氨基甲酰化的水平。空气中也存在氰酸盐（≤200 U/万亿体积）。吸入5倍浓度（1 U/百万体积）氰酸盐，可以生成1个100 μmol/L的水溶液[4]。氰酸盐在空气中有多种来源，如生物质燃烧、燃煤、生物燃料的使用、烹饪、吸烟和野火。除了上述提到的机制外，赖氨酸氨基甲酰化转移酶能催化游离氨基酸的氨基甲酰化。这种酶催化游离赖氨酸和氨基甲酰磷酸盐生成高瓜氨酸。然而，这种酶是否能够催化氨基甲酰磷酸盐和赖氨酸侧链之间的反应，尚无研究。氨基甲酰磷酸盐注入大鼠可造成大面积氨基甲酰化[5]。因此，凋亡或坏死细胞造成的氨基甲酰磷酸盐或赖氨酸氨基甲酰转移酶的释放可能是目前引起氨基甲酰化的另一原因。在这个过程中，通过酶使蛋白质氨基甲酰化似乎不太可能，显然需要进一步研究。

1.3　氨基甲酰化的生理作用

1.3.1　在分子水平上的作用：

氨基甲酰化可发生在蛋白质、细胞和组织水平。氨基甲酰化产物是一种生物活性物质，能够引起特定的或异常的细胞反应，以降低酶和激素的活性，已报道的反应物有血浆铜蓝蛋白、天冬氨酸分离酶、AST、MMP-2和胰岛素等多种酶和激素。氨基甲酰化可能影响蛋白的某一特定功能，而其他功能属性保持不变。例如，氨基甲酰化的红细胞生成素（CEPO）失去了红细胞生成和血管基因的功能，但仍有组织保护作用。因此氨基甲酰化的促红细胞生成素可能与肾病患者的贫血貌有关[6]。体外和体内实验均表明，氨基甲酰化改变血红蛋白和人血清白蛋白对目标配体的亲和力。氨基甲酰化的血红蛋白A增加了对氧的亲和力。相反，氨基甲酰化的人血清白蛋白对小分子酸亲和力下降。

氨基甲酰化蛋白的作用包括改变蛋白质的聚合能力、对蛋白酶的敏感性以及抗原抗体间的亲和力。例如，氨基甲酰化的胶原蛋白、微管蛋白和肌动蛋白的聚合能力明显降低。氨基甲酰化的谷氨酸脱氢酶更容易消化链霉蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。氨基甲酰化也能改变血型特异性糖蛋白与其自身抗体之间的亲和力。理论上，在体外任何蛋白质都可以被氨基甲酰化。然而，各种蛋白氨基甲酰化的敏感性不同，取决于各种参数，例如赖氨酸、精氨酸的数量及可获得性、蛋白质的寿命等[7]。氨基甲酰蛋白构象的改变导致蛋白质功能部分或全部丧失，从而导致酶（血管内皮生长因子2、金属蛋白酶组织抑制剂2）和激素（胰岛素、胰高血糖素、促肾上腺皮质激素及促红细胞生成素）活性的改变。

氨基甲酰化除发生在蛋白质外，也可以发生在所有游离氨基酸的N末端。未修饰的游离氨基酸有抗氧化作用，但氨基甲酰化的游离氨基酸失去抗氧化功能。同样，氨基甲酰化含有硫醇基的小分子，可以降低它们依赖硫醇基的抗氧化能力并且有助于提高活性氧自由基的水平（reactive oxygen species，ROS）。此外，氨基酸N末端的氨基甲酰化能阻止蛋白质的聚合。总之，剂量依赖的氨基甲酰化改变了大量蛋白质和小分子的结构和功能，这可能会进一步影响细胞功能，进而引起系统性疾病。

1.3.2　在细胞水平上的影响：

氨基甲酰化的蛋白质和小分子对细胞的正常功能有影响。据报道，高浓度的氰酸盐对红细胞等有细胞毒性。然而，低水平的氨基甲酰化也许在以下几个方面改变细胞功能：用剂量依赖的氰酸盐体外孵化可使骨髓细胞蛋白质合成减少，胰岛B细胞分泌胰岛素减少[8]、人中性粒细胞产生的ROS减少。然而，依赖氨基甲酰化引起上述变化的关键蛋白在很大程度上是未知的。除了氰酸盐对细胞功能产生的影响外，氨基甲酰蛋白间的相互作用也在影响细胞功能过程中起关键作用。例如，氨基甲酰化的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）增加系膜细胞胶原蛋白的水平，这与肾小球损害相关。此外，单核细胞对氨基甲酰胶原蛋白的黏附力显著增强[9]。一般来说，低水平的氰酸盐或氨基甲酰化程度低的蛋白质已经足以引发生物效应。

1.3.3　对组织的影响：

由于对蛋白质和细胞功能的影响，氨基甲酰化也可产生组织影响，如神经毒性和肝毒性。氰酸盐是治疗镰状细胞贫血的代表之一，它可以改善患者的血液学参数。然而，在动物模型中发现了其神经毒性和白内障的不良反应。对于终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）患者，由于其氰酸盐浓度相对较高，也会出现同样的表现。镰状细胞贫血的患者接受氰酸盐治疗后超过一半出现神经传导异常，甚至一些患者出现更严重的多神经病。以上描述的神经毒性可能与厌氧半胱氨酸代谢降低以及氰酸盐诱导的氧化应激增加有关。在小鼠大脑和肝脏中厌氧半胱氨酸代谢降低可能是由于氰酸盐抑制一系列酶参与谷胱甘肽代谢造成的[10]。

2　氨基甲酰化在疾病中的意义

2.1　RA：

RA是一种慢性、系统性自身免疫病，主要影响关节滑膜。该疾病症状包括关节的红、肿、热、痛、晨僵，最终可导致功能丧失。其诊断依据为2010年ACR/EULAR诊断标准，包括受累关节数、血清学指标、炎症指标和症状的持续时间。

研究表明在RA、有早期RA症状或关节痛患者体内发现抗氨基甲酰蛋白抗体（carP）[11]。出现抗氨基甲酰蛋白抗体的关节痛患者发展为RA的风险较高。有抗氨基甲酰蛋白抗体的RA患者的关节破坏比没有抗氨基甲酰蛋白抗体的RA患者更严重。与RA有关的抗体有RF、抗环瓜氨酸蛋白抗体（ACPA）等，ACPA是RA的最重要血清学标记，但只出现在约60%的RA患者。近年来，更多的转录后修饰与自身抗体的生成有关，可以作为新的生物标志物。有报道称45%的RA患者可以检测到抗氨基甲酰蛋白抗体（anti-CarP）。对于ACPA阴性的患者，抗氨基甲酰蛋白抗体的存在与严重的影像学表现相关。另外，抗氨基甲酰蛋白抗体可提前数年出现在RA患者体内，并可独立于抗CCP抗体预测关节痛患者发展为RA。抗氨基甲酰蛋白抗体的靶目标可以是氨基甲酰化的纤维蛋白原或维生素。总的来说抗氨基甲酰蛋白抗体比ACPA的敏感性低；然而，同时评估抗氨基甲酰蛋白抗体与ACPA对RA的诊断非常有利。更重要的是高达30%的ACPA阴性的患者也可检测到该抗体。

抗氨基甲酰蛋白抗体的存在不仅局限于成人患者中，也可以在幼年特发性关节炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）中出现。在JIA中，抗氨基甲酰蛋白抗体（anti-Ca-FCS或anti-Ca-Fib抗体）阳性率为16.7%（39/234），这高于ACPA（6.4%）和RF-IgM（8.1%）。与ACPA阳性的幼年特发性关节炎患者相似，抗氨基甲酰蛋白抗体阳性的JIA患者比RF阳性患者多关节疼痛更严重。总之，抗氨基甲酰蛋白抗体可以在ACPA阴性、ACPA阳性的"pre-RA"患者以及确诊的RA患者中检测到。因此，抗氨基甲酰蛋白抗体在识别（ACPA阴性的）"pre-RA"患者和需要早期、积极临床干预的初发RA患者中可能是一个很有价值的生物标志物。氨基甲酰蛋白可能以表位的形式，诱导自身抗体抗氨基甲酰蛋白的产生，从而在RA的发病机制中发挥重要作用。

2.2　慢性肾脏疾病：

在慢性肾功能衰竭中，氨基甲酰化是尿素增加的结果，同时可能是促进疾病恶化的原因。例如，氨基甲酰白蛋白能够促进肾小管细胞破坏，促进管周纤维化。此外，氨基甲酰血浆蛋白刺激肾小球细胞增殖及胶原合成，从而加速肾脏纤维化。蝾螈的肾脏疾病模型也可见氨基甲酰化的病理改变，给蝾螈注射氨基甲酰化蛋白引起蛋白存储和肾脏纤维化[12]。细胞外基质的重塑导致酶的失活或胶原不平衡的塑形可能是纤维化的另一原因。在尿毒症患者中，这种多形核中性粒细胞氧化功能的失调可能导致炎症和传染性疾病[13]。尿毒症促进自由氨基酸向氨基甲酰化氨基酸的转化，这些被认为是尿毒症毒素，因为它们干扰蛋白质合成、转氨反应以及胰岛素抵抗。氨基甲酰化的程度与肾功能的其他指标有关，如肌酐、半胱氨酸C、蛋白酶抑制物C和肾小球滤过率等，很难判断氨基甲酰化单独对肾功能的作用。最近，2个有关氨基甲酰化蛋白在终末期肾病中的预后价值的研究表明：氨基甲酰化是引起肾功能障碍的独立危险因素。

终末期肾病是慢性肾病的最后阶段，肾功能衰竭是永久性的，医疗干预措施（透析或肾移植）是患者生存所必需的。最近的一项独立研究表明：在排除了其他危险因素后，白蛋白上赖氨酸的氨基甲酰化基线百分比似乎分别是终末期肾病的危险率及病死率。总之，氨基甲酰化程度似乎是慢性肾病患者一个重要的独立预后指标。然而，氨基甲酰化是如何加剧慢性肾脏病的，仍是个谜。

2.3　白内障：

与神经毒性不良反应相似，一些患者在治疗镰状细胞贫血过程中口服氰酸盐后出现白内障。这个现象解释了氨基甲酰化晶状体蛋白，通过改变晶状体的三级、二级结构和增加链间二硫键引起聚合[14]，最终导致晶状体浑浊。现在证实，长寿蛋白特别容易发生转录后翻译，而且其氨基甲酰化可导致晶状体老化和白内障。

2.4　心血管疾病（cardio vascular disorder，CVD）：

与慢性肾病相似，在心血管疾病中也可见氨基甲酰化水平增加，这与临床不良事件相关。与健康对照相比发现，在动脉粥样硬化性心血管疾病和收缩期心力衰竭患者血浆中，氨基甲酰蛋白水平增加。在动脉粥样硬化中，氨基甲酰LDLs（cLDLs）似乎发挥关键作用。在体内，氨基甲酰LDLs清除减少，可能更容易氧化。另外，巨噬细胞清道夫受体能够识别cLDLs[15]。已有报道，cLDLs能够促进单核细胞对内皮细胞的黏附，导致内皮细胞死亡，刺激血管平滑肌细胞增殖，诱导氧化应激，加速人类内皮细胞衰老。LOX-1表达的增加可能会形成一个正反馈，清除更多的cLDLs和氧化的低密度脂蛋白。接触cLDLs也能诱导血管中一些细胞黏附分子的表达，这可能引起免疫细胞的浸润[16]。目前，用于检测血清cLDLs的方法只有ELISA。这种方法简单、便行，但由于尚未标准化，还没有常规使用。

氨基甲酰化的HDLs通过促进泡沫细胞的形成导致动脉粥样硬化。此外，其他位于细胞外基质的氨基甲酰蛋白也许是引起血栓栓塞事件的始发因素。例如，氨基甲酰化的胶原能刺激单核细胞产生MMP-9，增加动脉粥样硬化的动脉壁细胞外基质转运，有利于动脉粥样硬化板的断裂。动脉粥样硬化的患者高密度脂蛋白氨基甲酰化的程度也与病变的严重程度及MPO介导的氧化应激有关[17]。总之，几个关于氨基甲酰化HDL和cLDL的体内研究能部分解释这个发现。

3　讨论

综上所述，氨基甲酰蛋白是一个非酶的、转录后修饰，能参与一些疾病的致病过程，如RA、慢性肾病和心血管疾病。尽管它可能没有对蛋白质结构产生重大影响，但氨基甲酰化改变了许多蛋白对它们配体/受体的亲和力。

尿素水平增加或炎症导致氨基甲酰蛋白的堆积，以剂量依赖的形式加剧慢性肾病和心血管疾病的进程。此外，氨基甲酰化生成的新的表位可能触发自身抗体的形成，由此为自身免疫性疾病/症状，如RA的发病机制提供了一种新的思路。大量有关氨基甲酰蛋白参与病理生理过程常见机制的研究表明：尽管氨基甲酰化从未构成一种疾病的唯一初发因素，但它首先是一个过程的结果，然后通过促进长期并发症的发展成为加重因素。

迄今为止关于氨基甲酰化的研究都集中在氨基甲酰化后蛋白质功能的潜在变化，但我们认为在RA和其他疾病中，它实际上是打破免疫耐受以及抗氨基甲酰蛋白抗体诱导的免疫反应，通过免疫复合物的形成推动氨基甲酰化的病理进展。

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