胶滴肿瘤药敏检测技术(CD

夜游神

胶滴肿瘤药敏检测技术(CD

       恶性肿瘤是一类严重威胁人民生命和健康的疾病。近年来，某些恶性肿瘤的化疗效果有了明显提高，但多数肿瘤尤其是实体瘤疗效仍不理想。由于肿瘤异质性的存在，使不同的肿瘤类型或同一肿瘤类型的不同病人对药物的敏感性不同，治疗效果差异很大例如胃癌患者的单药有效率仅为15%-30%，MMC有效率为30%，5-Fu有效率为21%，EDI有效率为19%，联合化疗的有效率也仅为30-50%，可以看出目前肿瘤的临床化学治疗具有一定的盲目性。此外由于化疗药物多具有细胞毒性，不当的治疗不仅会贻误治疗，还会产生严重的毒副作用和联合耐药，最终导致治疗失败。因此，如何提高化疗用药的针对性和准确性，科学的使用化学药物是肿瘤化疗中需要解决的实际问题。

一、化疗方案如何制定？

       肿瘤化疗方案的制定分两类：规范化化疗和个体化化疗。规范化化疗方案是临床医师根据经验所采用的经典和标准化化疗方案；个体化化疗方案是通过肿瘤化疗药物敏感试验筛选出的，针对不同肿瘤患者制定的个性化方案。肿瘤的化疗需要考虑药物、肿瘤和个体三者相互制约的关系。即使是同一病理组织类型、分化程度相同的肿瘤，对同一个药物的敏感程度也存在较大差别。规范化化疗和个体化化疗相结合是临床肿瘤化疗今后的发展方向。因此，在化疗前，进行肿瘤化疗药物试验十分必要。

二、何谓肿瘤化药物敏感试验？

       肿瘤化疗药物敏感试验即利用患者手术切除的肿瘤组织、胸腹水等活体癌细胞，进行体外培养，并加入多种抗癌药物来筛选敏感的化疗药物，根据筛选结果，指导临床医生进行个体化化疗方案的制定，以期提高癌症患者的疗效和生存率，避免不必要的毒副作用。

三、肿瘤化疗药敏试验的种类？

       肿瘤化疗药敏检测有体外与体内两类检测方法。自人们20世纪50年度有人提出对肿瘤病人进行个体化治疗以来，国际上相继建立了一系列体内、外药物敏感性试验技术。目前具有代表性的有以下几种体外药敏实验：琥珀酸脱氢酶抑制实验(SDI)、四唑蓝比色法（MTT）、ATP生物荧光体外药敏检测法（ATP-TCA）及立体组织培养药物测定实验（HDRA）。国内以往常用MTT法，现已逐渐淘汰；而欧美常用ATP-TCA法。这些方法不同程度的部分解决肿瘤个体化治疗的问题，但均存在所需细胞数量多，不能解决小量标本进行药敏检测的问题。在此种研究背景下，人们建立了胶滴肿瘤药敏检测技术（CD-DST），一种体外肿瘤药敏检测技术，其突出特点是能够排除成纤维细胞对实验的干扰，在体外对抗癌药物的特异性杀伤作用做出客观评价，同时所需标本量小（3×103个细胞/孔）的特点扩大了该技术的应用范围，弥补了目前其它药敏技术的不足。国外临床研究表明此技术的体外检测结果与临床疗效间存在较好的相关性。CD-DST技术作为一种先进的体外肿瘤药敏检测技术，对化疗药物杀伤肿瘤细胞有效性的评价、化疗方案的筛选以及肿瘤化疗个体化治疗的推广均具有实际意义。国外研究表明，该技术的应用能够提高恶性肿瘤患者的疗效和临床医师用药的科学水平。

四、CD-DST技术

1.CD-DST原理

       由于人体内的肿瘤组织是由肿瘤细胞、正常细胞和细胞外基质共同组成的细胞群体，肿瘤细胞生长的微环境对肿瘤细胞生长产生重要影响。CD-DST技术是利用胶原凝胶在37℃时形成的三维立体结构的特点，在体外模仿了体内肿瘤细胞生长的微环境，使肿瘤细胞能够在与体内环境相似的条件下生长，生长的肿瘤细胞具有与体内相似的细胞形态特点。经过7天的培养后，经干胶、染色、扫描等程序最终对化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用程度做出客观评价。

       如图所示，CD-DST技术利用胶原酶消化细胞外基质，将肿瘤单细胞包埋于I型胶原中，形成胶原凝胶，肿瘤细胞在三维立体环境中生长，然后在近似于体内环境的条件下中评定药物对细胞的作用。

胶滴肿瘤药敏检测技术(CD

2.CD-DST技术特点

       1979年，Yang J等提出了一种新型体外细胞培养技术，将乳腺癌上皮细胞种植到胶原中以形成三维立体结构，从而达到使其生长类似于体内细胞生长状态。随后Miller BE 及Nakagawa H等人证实了肿瘤细胞在胶原中培养具有克隆形成率高、与体内细胞形态相似的特点，将此技术应用体外药敏实验。1997年Kobayashi H等采用此种细胞培养技术，结合其他体外药敏试验优点，报道了CD-DST这种新的体外药敏检测技术。CD-DST技术具有以下特点：

（1）细胞用量少

       由于所需标本细胞数量少，不仅可对小量的组织标本进行药物敏感性测定，而且可以对胸腹水等液体标本进行检测。从而使乳腺针吸活检标本、胸水标本、组织活检标本可以进行体外药敏检测，扩大了肿瘤药敏技术的检测范围。

（2）标本培养成功率高

       肿瘤细胞在胶原凝胶所形成的三维立体培养环境中，培养成功率高，细胞具有与体内细胞相似的生长形态。

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（3）采用图象软件系统分析结果，客观准确

       通过图象软件系统进行分析，排除成纤维细胞对实验的干扰，可对抗癌药物对肿瘤细胞的特异性杀伤作用在体外做出客观评价。研究报肺癌细胞和成纤维细胞经过中性红染色，具有明显不同的特点。

（4）结果测定快速（3秒/滴）

       结果利用计算机进行结果分析，测定6种药物的时间只需1分钟。

3.CD-DST技术流程

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        （1）肿瘤细胞悬液制备：将新鲜瘤组织剪碎成0.5-1mm碎块，加入消化酶（胰酶、胶原酶）消化2-3小时，待细胞分散后，通过80um的筛网过筛，得到细胞悬液。

       （2）肿瘤细胞的原代单纯层培养：将上述细胞悬液加入到I型胶原蛋白包被的细胞培养瓶中培养24小时，弃上清中未贴壁的死细胞。

       （3）胶原蛋白凝胶内培养：将细胞用胶原酶消化后，收集活细胞并计数，将活细胞滴入胶原凝胶液中。将胶原和细胞混合物接种于六孔板37℃培养，1小时后加入培养基，培养过夜。

       （4）待测药物的添加：在六孔板中加入抗癌药物，在不同药物浓度作用下培养24小时。清洗并除去抗癌药物后，无血清培养7天。

       （5）结果测定：中性红染色固定、扫描，结果传输计算机。利用图象软件分析药物的抑制率，评估药物物体外杀伤作用。

       （6）结果评价：通过图象软件，对图象进行分析。在设定亮度值128为阈值，排除亮度值在128-255之间的成纤维细胞，直接对亮度值在0-128之间的肿瘤细胞形成的克隆进行光密度的计算（D），结果传输到计算机，计算出分析药物的抑制率。
      
                       D=log10（投射光总量/透射光总量）

       药物体外敏感性用T/C的百分比值表示，其中T为加药处理组的光密度值，C为空白对照组光密度值。如果T/C的百分比值≤50%则认为药物在体外敏感。

4.国际上CD-DST临床相关性研究

（1）标本可评价率研究

       Kobayashi H等人研究表明，CD-DST技术标本可评价率较高，不同肿瘤类型标本的总体评价率为82%，结果如表1所示。经过统计学分析可发现不同类型的肿瘤标本的可评价率均无显著差异。同时通过对小量标本（针吸和活检）进行药敏实验，标本总体评价率为78.6%，结果如表2所示。因此CD-DST技术对小量标本的检测同样具有标本可评价率高的特点，可以弥补目前其它体外药敏技术无法对小量标本进行检测的不足。

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（2）药物体外敏感性和临床单药治疗有效率的比较研究

       药物体外敏感性和临床单药治疗有效率的比较结果如表3所示，经过统计学分析，可以发现药物体敏感性结果和实际临床单药治疗有效率有较高的吻合率。

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（3）CD-DST体外药敏测定结果与临床疗效的相关性研究

       1996年，Inaba M等首先证实此方法在体外进行药物敏感性监测的可行性，随后进行了临床相关性研究。体外药敏检测的肿瘤标本包括胃肠道肿瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、食管癌等多种肿瘤类型。研究资料统计结果表明CD-DST体外药敏测定结果与临床疗效具有较好的相关性，其中阳性预测值为79.8%、阴性预测值为88.8%、特异性为80.6%。

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5.CD-DST技术在临床中和科研中的应用

（1）指导临床化疗用药，设计个体化治疗方案。

       建立可靠的体外肿瘤药敏检测方法，可以帮助临床医师选择有效的化疗药物，有的放矢的设计个体化治疗方案，提高临床治疗效果。国外研究结果表明，CD-DST辅助临床进行化疗方案的确定，取得了较好的临床效果。

（2）为非常规化疗肿瘤设计化疗方案

       CD-DST技术在一些非常规化疗肿瘤设计治疗方案中得到了应用。食管癌、非小细胞肺癌、消化道肿瘤等均为高发的非常规化疗癌种，同时所得到的标本细胞数量较少。通过CD-DST技术的应用，可以对小量的标本进行检测，从众多药物的种筛选出对肿瘤患者有效的药物，指导临床化疗的应用，提高医生科学用药的水平。

（3）与肿瘤有关的基础研究

       Bcl-2高表达能够提高非小细胞肺癌细胞对DTY的敏感性。P-gp高表达能够肺腺癌细胞对CDDP的敏感性。Bcl-2和P-gp是否可作为一种肺癌细胞药物敏感性的分子标记需进一步研究。作为一种先进的技术，CD-DST技术在肿瘤相关基因基础研究领域中可能会有进一步的应用。

                                                                                                                                    编辑：范伟伟