母血清开放性神经管缺陷&唐氏综合征的产前筛查

岚峰pisces

在每1000个正常出生的婴儿中有1到2例发生开放性神经管缺陷，每1000例正常出生的婴儿中有1.6例发生唐氏综合征。 即使在孕早期筛查过程中出现了唐氏综合征的标记物，考虑到以下几个因素，孕中期的测试亦具有重要的意义：
      1.需要在孕中期时使用甲胎蛋白（AFP）筛查开放性神经管缺陷。
      2.有很大一部分孕妇在孕中期前并未注意产前保健，因此有必要精确地确定中期妊娠期的唐氏综合征的生化标记物测定值。
      3.孕早期筛查时， 除了使用绒毛膜促性腺激素游离β 亚基(βhCG)以及妊娠相关性血清蛋白A (PAPP-A)作为生化标记物外，还可以使用颈后半透明带的测量值，尽管该值不常使用，但仍须由有资格的超声波检查医师或具有超声检查经验的医生负责检测。
      4.如果未检测颈后半透明带，仅使用两种孕早期生化标记物进行筛查时，检出率仅为60%，假阳性率为5%。因此，不推荐使用这种筛查方法。然而，将使用PAPP-A检测结果的早孕期筛查方案与中孕期的三种测试标记物（甲胎蛋白, 游离雌三醇uE3，人绒毛膜促性腺激素hCG）或四种测试标记物（甲胎蛋白、游离雌三醇、 人绒毛膜促性腺激素、抑制素A（DIA））的测试结果相结合，无疑是一个有效的筛查方法（血清整体试验）。此方法可以提高孕中期筛查的效果。
      中孕期产前筛查的四个生化测定值（AFP, uE3, hCG, DIA）以及风险评估值对孕妇和胎儿的健康起到积极的作用。为了确保试验结果的可靠性必须充分考虑：分析前期，分析中，分析后期。另外，还应考虑风险评估、结果评估以及信息管理的准确性。Knight与美国国家儿童健康和人类发展研究所制定了综合性的临床实验室质量控制。
一、样本的采集与处理
1. 样品采集
      按照无菌操作常规，用静脉穿刺术采取孕妇静脉血2～3ml,收集于真空干燥采血管中。羊水诊断后不能采集样本，因为羊水诊断通常造成与操作相关的母血清AFP水平的升高，并影响分析物的水平。
2. 样品处理与储存
2.1 血清
      不能使用乳糜性或严重溶血性的样品。不能长时间的使用止血带，将血样采集到不含抗凝血剂的真空玻璃或塑料管中。将样品在室温下放置30至45分钟直至血凝块收缩为止。短时间的离心之后，直接抽取回缩的血凝块上方的血清样品。通常，母血清中的生化标记物非常稳定，可以在周围环境条件下运输。然而，在分析或运输之前，应立即将血清从血凝块中分离出来并冷冻储存。
2.2 血浆
      不推荐使用血浆作为病人样品，除非生产商说明书特此说明。
2.3 样品储存
      采集的样本在室温或4℃条件下可以保存6天；在-20℃条件下，可以最多保存6个月；在-70℃，可以无限期地进行保存。血液采集后，应在两天内将样品送至实验室。
二、参考物质校准母血清标志物检测系统
1．WHO标准
      世界卫生组织的人类AFP标准品是冻干血清。
2．英国标准
      英国首批人脐血标准品（72/227）使用与WHO同批次的脐血材料制备，但是它使用了不同的冻干技术。 英国的参考材料按照WHO（72/225）进行标定。
3．纯AFP标准
      当前不存在按照质量单位进行标定的纯标准品或天然AFP
4．推荐的美国国家参考物质的成分
5．hCG 标准化
      大多数h C G 参考标准品是根据世界卫生组织（WHO） 第一代IRP(75/537)及第三代国际标准品（IS）(75/537)进行标定的。
6．雌三醇标准物：游离雌三醇
      雌三醇分析中不存在“金标准”。在选定的病人组中，许多分析方法经标准化后与气相色谱-质谱分析法（GCMS）具有良好的相关性。测量游离雌三醇时，许多免疫分析方法都会存在基质问题。大多数游离雌三醇分析都用于测量母体血清中天然的游离雌三醇。人工样品，包括其它试剂盒的校准品、特定的能力验证样品、以及某种质控品恢复后比原有数值低2-3倍。能力调查是通过同等的组进行分级，而不是通过采用所有方法实现的。
三、妊娠期间影响生化标记物检测的因素
1．母体血清检测
      孕中期的早期，孕龄是影响血清标记物浓度变化的主要因素。两种血清标记物将随着孕龄的增长而增长（AFP每周增长15%，uE3每周增长25%），一种(hCG)将呈指数形式下降，DIA则改变不大。由于稀释作用与体重增高时血容量的增加，母亲的体重将影响血清标记物的浓度。还存在一些与体重或其它已知因素的人种差异（例如非洲血统妊娠妇女的母血清AFP水平比白种人高）。患有胰鸟素依赖型糖尿病（IDDM）的妊娠妇女的母血清AFP水平较低（低20%左右）。筛查过程中对血清标记物水平进行说明时应考虑上述因素。在每个孕周中，正常妊娠和患有NTD妊娠的AFP浓度分布会出现重叠的部分。母体血清中尤为常见，羊水中则较为少见。因此，所选的AFP浓度的截取值必然会引起一定程度的假阳性率和检出率。
2．母亲体重对于uE3, hCG和DIA的作用
      AFP, uE3, hCG和DIA都来自于胎儿的胎盘，所以母亲体重影响的机制适用于各个分析物，也就是说，母体循环血浆容量将会影响分析物的浓度。许多研究已公布了母亲体重所产生的影响。所有研究表明母亲体重与血清标记物水平之间呈反向关系。hCG 和DIA与母亲体重之间的关系与AFP与母亲体重之间的关系类似，然而对于uE3的影响较低。这是由于游离雌三醇的半衰期较短，所以它对于母亲体重的依赖程度较小。
3．测试时的孕龄
      孕龄是从末次月经期（LMP）的第一天开始估算。由于孕中期的四个生化标记物中，有三个浓度持续发生变化，用MoM表示时，孕龄估算有误差，将会造成标记物值假性地升高或降低。这些误差将会降低筛查的性能。通过减少这些误差，超声波估算可以提高筛查的性能。因此，建议在取得生化结果之前使用超声检查来估算孕龄。孕中期时，双顶径是超生检测孕龄的最佳指标，孕早期时则为顶臀长度。在筛查前使用超声波进行测定孕龄的检查还可以识别出是否多胎妊娠，妊娠妇女可以确定是否希望继续接受筛查。对NTDs进行MSAFP筛查时，最佳的AFP测量时间是16到18周。孕龄小于15周，或大于21周，不适宜筛查，因为此时缺少标准数据，且选择合适的时间进行后续诊断比较困难。早期妊娠时，不存在有效的NTD生化标记物。由于考虑到上述相同的因素，三重或四重测试中使用多标记物筛查唐氏综合征时，最佳的筛查时间在14到18周。不建议在14周之前进行这两种筛查，但直到孕21周时都可以进行筛查。孕早期时具有可用于筛查DS的有效生化标记物，特别是孕10到11周时的PAPP-A。
四、孕中期标记物浓度的模式
      母体血清标记物浓度的某些模式将说明胎儿发育过程中所患的疾病的种类，详见下表。

五、质量保证
1．参考值
      母体血清标记物筛查的参考值包括一套中位数值，它是实验室通过对需要筛查的人群进行测试后，根据获得的分析结果来记算每一个孕周的数值。使用不正确的参考数值是导致实验室MSM筛查结果不正确的常见原因。 因此筛查实验室需要建立自身的参考数值或证实其它来源的参考值适用于将要筛查的人群是非常重要的。每一个MSM的测试结果将表示为未患病人群中位数的倍数（MoM），它是通过将每一个MSM值除以相应孕周中位数值后得到。
1.1 建立母体血清的中位数值
      水平测试程序证实当直接使用检测单位结果（例如ng/mL），实验室间母血清标志物（MSM）检测值间可以相差15%。主要的原因是由于生产的试剂盒间的偏差造成。使用已公布的数据作为中位数值并不可取。实验室可以尝试使用包装说明上的参考数值作为中位数。然而已经证实某些试剂盒的中位数具有明显的错误，会造成大量的假阳性（或假阴性）筛查结果。由于孕期可靠性的差异等因素，生产商说明上提供的数据不适合于建立中位数值。因此建议每一个实验室根据用于筛查的试剂盒以及从筛查人群中获得的样品来建立自身的参考值。
      在计算中位数值时，没有必要要求计算中位数时的所有样品都是“正常”、未患病、单胎的妊娠。 导致MSM值超出范围的情况，例如双胞胎、胎儿死亡、开放性胎儿缺陷以及IDDM等只占很小的比例。 如果使用未经选择人群的测量结果时，它们对于中位数值产生的影响很小。 实际工作中，可以通过来自于本地人群每个孕周（16-18周）的100份样品制定筛查计划的中位数（如果允许，可以包括较早或较晚孕周的数据）。 在加权对数-线性回归中使用这些数据（为AFP和uE3）来计算正常的中位数，如下所述： 首先使用MSM值来计算中位数值。 随后进行对数线性回归分析，并按照每个孕周时的数据点数来进行加权，从而获得方程式。 通过数学计算过程可以为孕周的每一天生成“平滑”的中位数值（重要的是要存储所计算的回归线的斜率与截距）。 在孕14-25周时这种对数-线性关系有效，在数据较少的孕周时可以根据其来推断相应的中位数值。 目前这种方法已经公布。对于hCG，应使用指数回归，DIA使用二次回归。
      如果实验室不能从本地人群中获得充足的样本来完成这一步骤时，可以使用来自于其它实验室的血清样品，进行分析后建立中位数值。本方法的不足之处是不同的人群中病人样品有可能具有差异。或者实验室可以与使用相同试剂盒实验室的中位数值作为自身的中位数。大约需要50-100份已经取得MSM值得样品并重新进行分析。如果MSM分析值得差异性在±5%之内，可以使用这一中位数值开始筛查。当获得充足的数据后，实验室可以按照标准的方式来计算其自身的中位数值。有时，使用相同分析方法的两个实验室间的MSM值具有原因不明的系统、连续性偏差。如果两个实验室确定其分析差异是真实存在、而且重复出现时，在此情况下，可以使用线性回归分析方法。CLSI文件EP9-使用病人样品进行方法比较和偏差评估中包含了对方法的深入讨论。
2．实验室质量控制
      实验室可以通过多种途径获得质控血清。可使用与MSM测试试剂盒一同提供的质控血清来检查试剂以及技术性能。然而，质控血清无法监测长期的变化，因为生产商为每一个批号质控品所提供的接受值的范围是使用特定批号的试剂盒与相应的质控品共同制定的。因此，强烈推荐使用生产商以外的质控血清。购买可供使用一年或数年的商用质控血清，或者使用由母体血清库制备的试样。实验室也可以通过重新分析过去存储的病人试样来监控分析的长期漂移现象。当前使用的血清应来自于计算中位数时的血清。当实验的结果改变超过5-8%时，相应的中位数值和筛查截取水平也将发生变化，我们应当确定是否有必要重新计算或调整参考数据。如果实验值变化恒定，而且中位数值的变化超过5%时，应使用发生变化后的数据来重新计算中位数。如果变化后所检测样品的数量不足，无法计算可靠的中位数时，可以根据所观测到中位数值变化的百分比，来为原有的中位数值使用一个调节因子。在对于试剂进行移液时，由于实验试剂/或操作技巧会随着时间发生变化，实验值也可以发生变化（短期漂移）。在进行大量的试管分析时（例如>100），很容易发生短期漂移。为了监测短期漂移，可以在实验的开始与结束时使用质控品，如果工作量非常大时，那么在整个实验间期需要不定期地使用。
2.1 内部检测质控
      应采用标准的实验室内部质控程序。这将包括确保获得满意的标准品曲线，以及通过使用分析物浓度在操作范围的质控血清（小于0.5MoM和大于2.0MoM）来监测批次内和批次间的变异系数（CV）。
2.2 风险评估的质控
     风险评估取决于所使用的统计模型，而后者又取决于正常和异常妊娠MSM的分布参数（平均数，标准差，及相关系数）。实验室应留意它们所使用的参数，并确保它们所使用的参数最合适。例如，AFP的标准差（SD）在最近几年中随着分析性能的改善而降低。而且，根据孕龄是使用LMP还是超声波进行诊断，应使用各自最为合适的参数组。这样可以确保实验室能取得最佳的筛查效果，即通过根据已有的假阳性率获得最高的检测率。
2.3 外部质控
      作为良好的实验室惯例， 进行筛查和诊断性MSM分析的实验室应该参加目前的母体MSM外部质控品（成熟的试验）程序。实验室应了解到提供实验室服务的国家或州的适用法规，以及他们必须参与的特定的水平测试程序。通过定期定量比较实验室结果与所有参与实验室结果间的统计学差异以及确定的参照实验室，来监测某一实验室的检验性能
3．筛查工作量
      实验室进行MSM测量时每周应至少对25个妇女进行筛查，只有这样，方可进行必要的流行病监控并积累足够的经验，具备审查筛查程序的能力。当确定可靠MSM筛查时所需的最少样本量时，我们有必要将实验部分与说明部分分离开来。MSM分析是最为可靠的免疫分析方法。水平测试程序时，实验室间的变异系数小于10%。因此，即使测试的样本量相对较小时，也可以获得可靠的MSM测试值。检测少量样本的实验室很难正确地解释MSM值。血清中MSM值会随着孕期、母亲体重、种族、是否患有胰岛素依赖型糖尿病、多胞胎的情况发生变化。为了能够正确的说明血清AFP测试结果，必须考虑每一项因素。
4．实验室技术要求
      除了实验室标准专家意见以外，进行筛查的实验室还应该注意以下几个问题：
（1）使用从本地取得的参考数据；
（2）应考虑影响MSM值的因素；
（3）为唐氏综合症患者提供专门的风险评估；
（4）提供流行病监控
（5）审查筛查计划
      由于在数学上可以对病人患神经管缺陷的风险进行评估，评估的准确度则显得不确定，这是因为神经管缺陷的患病率会发生变化，且筛查之前所进行的超声波检查可以识别出患有神经管缺陷的妊娠妇女并选择性地将她们从筛查人口中排除。
5．临床性能
      就大多数实验室来说，对所有接受筛查的妊娠妇女的筛查结果进行监控不太切合实际。因为在筛查过程中，（唐氏综合症以及神经管缺陷）的筛查患病率较低（1000个人中有1个），几乎所有的阳性结果都为假阳性，因此，阳性率和假阳性率几乎相等。例如，如果假阳性率为3%，那么1000个接受筛查的妇女中将会出现30个为假阳性，还有1个是真阳性（若筛查过程中发现此病例），所以，筛查得出的阳性率应为3.1%（1000个妊娠妇女中有31个，而不是30个检查结果为阳性）。因此，在了解它确实能反映假阳性率的前提下，实验室应借助于筛查阳性率来对其效果进行监控。例如，如果当期望值为3%时，而实际值却为7%，则实验室应对问题进行调查，原因可能归于标准中位数值有所变化。流行病监控的基本原理在于确定阳性率筛查的结果是否落在大型的有经验的筛查程序所得出的极限范围之内。
六、报告
      每一个实验室可以自行决定报告的内容。报告应当简明、清晰，需要具有带有单位的分析物检测结果和MoM数值，并按照预定的标准将其分类到筛查阳性、筛查阴性范围内。需要对于唐氏综合征筛查阳性的病例进行危险性评估，也可以选择评估阴性的结果。因为对于血清AFP增高的妇女评估危险性非常困难（因为使用叶酸和以前超声筛查的差异），所以对于这种情况进行评估并不恰当。建议实验室需要同医生、遗传学咨询人员、超声检查人员进行协商，并考虑到筛查过程中每一组人员的需求后发布报告。在报告建议中需要特别注意措辞的使用，因为它常常会造成医患间的纠纷。
      总之产前筛查不同于其他的一般检验项目，一般的检验项目是对患者本人，而产前筛查关系到两代人的健康。因此，这种高风险的检查项目应有质量规范才能保证检验结果的准确性，才能为患者提供优质的服务。