谈谈「布病」，说说诊断！

山泉

作者：福建省疾病预防控制中心  李曲文

布鲁氏杆菌（Brucella）是一种革兰氏阴性的不运动细菌，布氏杆菌属有六种：马耳他布氏杆菌（羊型布氏杆菌）、流产布氏杆菌（牛型布氏杆菌）、猪布氏杆菌和狗布氏杆菌、林鼠布氏杆菌、绵羊布氏杆菌。其中引起人类疾病的有羊、牛、猪和狗布鲁菌。布鲁氏杆菌感染引起的布鲁氏病（brucellosis），是一种人畜共患性全身传染病，简称“布病”，又有地中海弛张热、马耳他热、波浪热等称谓。

一、细菌分类

布鲁氏菌属分为6个种19个型，即羊种布鲁氏杆菌（3个型）、牛种布鲁氏杆菌（8个型）、猪种布鲁氏杆菌（5个型）、绵羊附睾种布鲁氏杆菌（1个型）、沙漠森林野鼠种布鲁氏杆菌（1个型）和狗种布鲁氏杆菌（1个型）。对人致病的是牛（B. abortus） 、羊（B.melitensis）、猪 (B. suis)、犬 (B.canis)、绵羊附睾(B. ovis)布鲁氏菌等种，可以通过饮食和受伤的皮肤、粘膜直接传染人类。其中，在马耳他“首秀”的羊种布鲁氏杆菌致病力最强。

二、细菌培养   

布氏杆菌为需氧或微需氧菌，最适生长温度37°C，最适PH为6.6-7.4，牛种部分型别、绵羊附睾种布氏菌需在5-10% CO2 条件下生长，初代分离菌株最好在CO2 条件下培养。在普通培养基上生长不良，需用肝汤、胰蛋白胨肉汤、马铃薯培养基、巧克力平板或特制的布氏菌培养基上生长。此菌生长缓慢，初代培养常需5-10天甚至20-30天可见生长。不过实验室长期传代保存的菌株或增菌液，培养24-72h即可生长良好。

2.1

图1、布鲁氏菌菌落形态

三、鉴定

1.镜检：革兰阴性球杆菌或者短杆菌，大小为（0.5-0.7um）×(0.6-1.5）um,两端钝圆，单个或者成对、短链排列，无鞭毛，无芽孢，不形成真正荚膜，光滑型有微荚膜（如下图）

2.3

图2、革兰染色镜下形态

2.生化反应：氧化酶阳性，分解葡萄糖，不分解阿拉伯糖和半乳糖，触酶、尿素、硝酸盐还原阳性，动力、硫化氢、吲哚、甲基红、精氨酸双水解酶试验阴性。

3.血清凝集实验：布鲁氏菌菌有A、M和G三种抗原成分，G为共同抗原，一般牛种菌以A抗原为主。A与M之比为20：1；羊种菌以M为主，M比A为20：1；猪种菌A：M为2：1。制备单价A、M抗原可用其鉴定菌种。

4.全自动生化鉴定仪：应用全自动微生物鉴定仪可以鉴定到种，如用Vitek2 Compact 中GN卡进行鉴定。

5.布病血清学检测

1）试管凝集反应（SAT）：生理盐水稀释待检血清至 1:25、1:50、1:100、1:200，1:400倍比稀释， 加入0.5ml抗原稀释液，摇匀，放37℃温箱中24小时观察结果。判定结果：每次需配制抗原比浊管作为判断依据。凝集价在1:100(++)以上者为阳性，1:50(++)为可疑。

可作为布氏菌病早期诊断及确诊实验，每份待捡血清需作1个血清对照，以排除血清的自然凝集。

2）虎红平板凝集试验（RBPT）

所用抗原是用虎红(四氯四碘荧光素)色素染成的一种酸性抗原，具有克服非特异性反应，对检查小分子抗体IgG较为敏感的特点。在清洁的玻片上加0.03ml的受检血清，然后再加入上述标化抗原悬液0.03ml，使充分混匀，在4分钟内观察结果，以出现可见的凝集反应为阳性。可作为初筛实验。

3）布氏菌素皮试试验（疫情，必要时）：机体接触过抗原，处于敏感状态，可以直接检查。变态反应原是由菌体提取的、以蛋白为主的生物性抗原。皮内注射抗原后，反应出现迟缓。一般在6小时以后局部开始浸润，表现为红、肿。④不能在同一机体重复，有时出现假阳性、假阴性。

6.分子生物学分型方法：

1）属基因水平：
BCSP31基因PCR方法，223bp
B4:5`-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3`
B5:5`-GCTTGCCTTTCAGGTCTG -3`

2）种水平的鉴定(AMOS-PCR)

⑴ B. abortus-specific primer ：
A: 5`-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3`

⑵ B. melitensis-specific primer ：
M: 5`- AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA

⑶ B. ovis-specific primer ：
O:5`- CGGGTTCTGGCACCATCGTCG-3`

⑷ B. suis-specific primer ：
S:5`- GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3`

⑸ IS711-specific primer ：
IS:5`- TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3`

2.4

图3  电泳图

1-5 AMOS基因扩增：1、阴性对照；2、羊；3、牛；4.猪；5、待检菌（羊）
6-10 BCSP31基因扩增：6羊；7牛；8猪；9绵羊附睾(B. ovis)；10待检菌（羊）

7.分子分型

1)脉冲场凝胶电泳(PFGE):内切酶：XbaⅠ.

2) 多位点可变数目串联重复序列分析( MLVA ):选取重复序列的16个位点，通过核酸提取、PCR扩增、电泳、BioNumerics软件分析进行分型。根据串联重复序列两端不同的基因组序列设计引物，扩增包含的片段，根据长度计算串联重复次数，串联次数的改变是细菌在繁殖过程中错配和重组产生的。

8、实验室生物安全和质量控制

1）强毒菌株、疫苗菌株、弱毒菌株均可能造成人体感染，但所需菌量会有较大差别。

2）布氏菌是高致病性菌株，布氏菌的抗原制备、菌种保存（冻干）在BSL-3实验室进行。未知标本分离菌、少量菌株实验、弱毒菌株的实验操作在BSL-2实验室进行。布病血清学实验可以在BSL-1实验室进行。

3）严格的菌种接收 鉴定、 保存、 使用和销毁制度。

4）建立风险评估和应急预案。

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