分子遗传检测的质量管理

姑姑机

卫生部临床检验中心     费阳 王治国
        摘要：临床和实验室标准化研究院文件MM20-A—分子遗传检测的质量管理，为执行遗传性或后天获得性疾病人类分子遗传学检测的实验室实施国际管理体系标准提供了指南。质量管理体系方法在国际上越来越多地得到应用，确保随着用户需求和要求变化实验室的服务质量。本文强调了各种分子遗传学实验室各个方面工作流程的质量管理活动，包括确保实验室与用户之间互动的质量和加强实验室/用户的相互交流。
        关键词：分子遗传学检测，工作流程路径，质量，质量保证，质量管理体系
  
        质量管理体系实践越来越广泛地应用于世界范围内的医学实验室，用于帮助提高实验室的服务质量和实验室运作效率。随着分子遗传学检测的快速发展，伴随着确保提供检测服务和质量持续的挑战。本文通过让实验室服务和活动成为扩展质量管理体系的工作流程的一部分，讨论质量体系应用在解决特定的分子遗传检测中质量管理挑战的要点，和在分子遗传检测实验室服务技术过程中应用质量管理体系的政策、过程和程序，为分子遗传实验室质量管理体系的实施和维持提供了指导。
一、分子遗传检测的类型和应用概述
        分子遗传学检测使用基于DNA和RNA的检测方法检测核酸的本质的或体细胞的改变。分子遗传试验除了可以检测在癌症和其他疾病中体细胞的改变，还可以检测出引起遗传性疾病和状况（遗传学和遗传药理学）的改变。这种试验可以用于疾病的诊断、携带者筛查、症状前/易感性的检测，同时也用于直接治疗干预（遗传药理学）。表1列出了遗传检测的主要类型。

二、提供分子遗传学检测服务和工作流程过程的概述
        由于生物医学研究和技术的不断进步，分子遗传学检测实验室面临着持续的需求，这些需求是考虑新的检测方法和程序，更新现有的检测程序和保证与使用者有效地交流。本文表明了一个分子遗传学实验室服务延伸的工作流程，本文是基于而且包含工作流程的核心途径，包括：检验前、检验中和检验后活动。
        提供分子遗传学试验的实验室工作流程应该包含以下主要组成成分：计划和准备，试验性能确认/验证，为实验室用户提供检测服务的过程，包括检验前、检验中和检验后服务。
        图1描述了分子遗传学用于提供服务的检测工作流程和它与临床医生和其他实验室用户的接口。

        质量体系要素来表明它们是QMS的“建筑基石”。
1. 计划和准备
        计划和准备阶段应表明大量的管理和技术方面，如质量要素的充足性、政府和地方的要求、新试验的需求、益处和花费、人员训练、知情同意、遗传学咨询、伦理问题等等。
2.试验性能确认/验证
        一旦做了决定去向实验室项目中引入分子遗传学试验，实验室应该选择试验模式，而且要决定哪一个试验程序适合实验室服务。对于分子遗传学试验来说，试验性能确认/验证应该考虑众多的因素，例如：试验的用途、靶基因、序列和突变、目标病人人群、可用的试验方法、接收的样品类型、干扰突变和多态性。
3.为用户提供检测服务
        当新的试验已准备好用于临床时，向实验室用户提供试验服务的过程，通常指的是检测全过程，包括检验前、检验中和检验后。
4.质量体系框架
        在质量管理体系执行中提供医学实验室常规指导的国际标准和指南可以从很多来源资料（见表2）中得到。提供遗传学检测服务的实验室应该参考这些文件来建立质量管理体系原则和实践。

三、 分子遗传学检测的技术过程
        此部分讨论了分子遗传学检测实验室中技术过程的质量管理体系政策和程序的实施，包括新试验在引入病人检测前的性能特征的确认/验证和为实验室用户提供检验服务的后续的过程。
1．试验性能确认/验证
        实验室技术过程包括确认试验性能的需要，此需要应该考虑作为提供分子遗传学试验服务的实验室全部工作流程的构成部分。
（1）评估用户需求和要求
        考虑实施和提供新试验的成本以补偿可能性。这可能通过咨询申请医生和其他实验室服务潜在用户，以及进行市场分析。
（2）评估临床有效性和实用性
        反映医学实验室决定采用一个分子遗传学试验的主要因素是试验需要满足临床需求。临床有效性指的是试验能够识别感兴趣的（通常是一个疾病状态）临床疾病，而且正确的识别未感染个体。对于遗传学试验，临床有效性指的是试验查出或者预测特定疾病或者显型的出现或者缺乏的能力，而且通常符合基因型和显型的联系。
（3）确认/验证程序发展
        对于任何的要确认或者验证的新分子遗传学试验，实验室应该确定建议检测的靶核酸、确定要使用的试验方法和建立试验性能确认/验证的计划和程序。
        确认/验明程序应该表明：试验的使用目的；靶基因，序列和突变；预期病人人群；被比较的试验方法，或者是要使用的选择方法；使用的样本类型；要确定的分析性能特征；参考材料的来源；如何分析性能规范，如何规定试验的局限性；出现问题时的纠正措施。
（4）分析确认/验证需要的样品和材料
        选择样品时，应该考虑以下因素：
        ①疾病的流行性和评估的变异。实验室不应该对罕见的疾病或者罕见的突变设定较低的标准；样品应该充足而适当以建立试验性能规范和规定局限性。
        ②包含需要进行检测的每种样品类型的样品（例如，血、口腔拭子、干血斑、新鲜或者冷冻组织、石蜡包埋组织，或胎儿样本）。
        ③实验室目标病人样品，考虑性别、年龄组、种族、健康/疾病状况和其他相关因
素。
        ④包含每个可能报告的结果（或者基因型）样板。
        ⑤要建立的性能规范。
        ⑥试验程序所需的质控品、校准品和其他参考材料
（5）确定分析性能特征并且定义性能规范及其局限性
        实验室执行的技术确认/验证程序应该决定新试验的性能规范和病人试验需要的质量控制程序。为了最优化试验性能的条件，在确认过程中第一步预先探索一些变量来缩小参数是有帮助的。
主要包括：
①分析准确度；
②精密度/不精密度；
③分析灵敏度；
④分析特异性；
⑤可报告范围；
⑥参考范围或者参考区间；
⑦试剂组成成分的描述和处理。
（6）记录
        全部的确认/验证程序，包括试剂、样品和使用的仪器以及结果，发现和结论应该得到详细有效的记录。
（7）病人样品检验操作程序的准备
        要建立检测病人样品程序，实验室应该表明以下遗传学试验特殊问题：
        ①对于遗传疾病的检测，特殊的问题包括知情同意和遗传咨询；
        ②伦理问题，包括未成年人检测，检测过的病人样品的使用和试验结果或家庭成员信息的保密性。
（8）持续进行的确认
        试验确认/验证数据的可接受和病人检测的新试验的实施不应该被认为是试验性能监视和评估的终点。持续进行的确认可以被考虑是对一个试验做出持续不断的改进。
2. 检验前活动
        提供给临床用户的实验室试验的工作流程，首先是检验前活动，将医学决定转变为实验室接收样品和病人信息的试验申请。此过程包括医学专家（和病人）完成的活动，实验室执行的活动实验室/用户接口处活动。
        对于遗传疾病，实验室提供的信息也对遗传学咨询过程有贡献，此过程帮助病人及其家属理解被怀疑的遗传学疾病，遗传方式，疾病管理试验结果的含义，生殖选择，和个人抉择。
（1）提供便利试验选择和申请、样品提交、试验执行和结果报告的信息
        执行分子遗传学试验的实验室应该清楚的理解科学基础、临床有效性、结果不确定度和他们试验解释的局限性。
① 检验前咨询
        遗传学咨询是帮助病人和有风险的家庭成员理解和适应医学的、心理的和家庭暗示对疾病的遗传学贡献的过程。实验室提供的试验信息对于遗传学咨询至关重要，提供个人和家人准确、完全和公正的遗传性疾病信息，包括考虑的遗传学试验的益处和限制、潜在的危害、和个人同相关人员试验结果的相关性，来支持和使做出有根据的决定可能。
（2）知情同意
        在医学环境中，知情同意是一个病人和医疗健康提供者（通常是内科医生）之间交流的过程，从而使病人批准或者同意承受一个特定的医学介入。知情同意的关键成分是效率、潜在益处、潜在风险和危害、局限性和可代替方案。
（3）试验申请
        试验申请请求信息应该包括：申请医师的姓名和联系信息、 至少两个唯一病人识别标志、年龄或者出生日期、性别、申请的试验、检测指标、有关疾病的家族史信息、疾病的相关种族性等等。
（4）样品提交和处理
        根据试验确认资料，样品的特定类型和体积（例如，细胞数量）是分子遗传学试验所要求的。虽然生殖细胞变异分析通常可以在任何可得到的具有核酸的体液或者组织中进行，样本的数量和质量能够根据试验方法和试验的变异范围的不同而不同。如，一个基于PCR分析的第五凝血因子突变可以使用从空腔拭子或者滤纸上血斑中提取的小量（例如，5～10ng）DNA，但是，使用Southern blot分析进行脆弱X染色体综合征FMRI完全变异的检查可能需要从2ml以上的全血中提取的纯化和定量的DNA几个微克。
        通常情况下，样本采集需要在二级生物安全保护条件下执行。样本应该使用适当的收集设备收集而且对于目标试验来说要足量。实验室应该建立标准来接收和拒收病人标本。不同的标本有不同的运输和稳定性要求。
3. 检验活动
        检验阶段包括检测样本的准备（核酸纯化等等）、执行检测、确认检测结果的可靠性和解释结果。实验室应该同时有内部和外部质量控制计划，包括规定的和记录的关于检测方法执行的质量控制、允许界限和纠正措施的过程和程序。
（1）试验检测阶段总的方面
        试验检测阶段的过程、程序和部门责任总结如表3所示。

（2）检验过程的技术程序
        每个分析遗传学试验的检测程序都应包括：检测目的、检测使用程序的原理、性能说明、检出限、测量区间、检测正确度、分析灵敏度、分析特异性、首要检测系统、容器和添加剂类型、需要的装备和试剂、校准程序、程序步骤、质量控制程序、检测过程通过/失败标准、潜在干扰和交叉反应、潜在变异来源等等如果实验室意图改变检测程序，那么结果或者他们的解释可以是非常不同的，在改变被采用之前，改变的含义应该编写来向实验室服务的用户做出解释。
（3）质量控制计划
        在每个新试验实施前，它必须有一个质量控制计划。编写的程序应该描述试验全部的质量控制要素。质量控制计划的详细监管要求可能随地区不同而不同；因此，当建立室内质控计划时，每个实验室应该意识到并且遵守。
1）质量控制计划要素
        控制品类型 分子遗传学试验控制品或者控制物质类型可能依据他们的来源、序列和他们包含的变异或者分析步骤或者他们控制的成分来设计。这些类型不是相互排斥的，具体如下：
依据来源：
①基因控制品； ②合成控制品依据代表的序列/变异：
①阳性控制品； ②阴性控制品；
③无模板控制品（包含除要扩增的核酸模板外的全部扩增程序的组成部分）
依据分析过程：
①提取控制品； ②扩增控制品：
③杂交控制品； ④内源性控制品；
⑤外部RNA控制品； ⑥内部控制品；
⑦检测控制品
        选择的控制品应该是均匀的从而使得任何的质量控制结果改变是由于检测系统导致，而不是控制品。阳性控制品应该是一个与低于中等范围内扩增一致的浓度。强阳性的使用是不必要的风险，因为它可能成为污染源。如果适当，接近检出限（LoD）的阳性控制品应该定期检测来确认LoD。阴性提取控制品监测在提取、扩增或者检测步骤中污染的出现。阴性扩增控制品监测扩增或者检测步骤中的污染。内部控制品在缺少表明阴性病人结果的扩增产物时使用。它们控制扩增过程的抑制剂。
        为了可以根据疾病流行性和变异频率来代表目标人群的基因型，试验中包含的控制物质应该尽可能的广泛。对于一个已知突变的序列分析执行，例如检测从前已经在实验室检测出的疾病变异病人的家庭成员，实验室应该使用病人样本作为检测的一个阳性控制品。
控制品的频率和位置
        实验室应该有控制程序来监测整个分析过程的每个检测系统的准确度和精密度。 频率应该是充足的来允许识别可能指示系统误差的偏移或趋势。通常，阳性和阴性控制品应该在每次病人样本被检测时进行检测，同时要检测无模板的控制品。在分析的1）提取（当适当而且实际的时候），2）扩增和3）检测阶段中应该采用控制样品。对于定量分析，包含分析测量范围的每日质控品应该用来确保维持准确的定量。
预防性措施
        当需要调查或预防性措施时，行动范围应该描述为适当的。例如，一个低于特定水平的低水平荧光信号可能表明一个靶探针应该被及时替换以防止失败运行。
附加的控制程序监视
①环境条件；
②病人数据趋势；
③校准、维护和监测检验仪器设备性能；
④保持单向工作流。
2）关于分子遗传学检测的质量控制挑战
        分子遗传学试验的一些方面提出了特定的质量控制方面的挑战。一些挑战在表4中列出，也包括一些可能的（虽然有时不完全）质量控制方法。

4. 检验后活动
        在检测活动完成后，会产生一个报告给申请检测的医疗提供者来传递检测活动的结果和解释。考虑到遗传疾病的遗传学试验也对家庭成员有影响，报告和样本的存档也应该由适当的程序支持。
（1）分子遗传学试验报告特点
        当决定分子遗传学试验报告的格式、类型、媒介和语言时，实验室应该评估实验室用户的需要。使用的语言，包括专业用语和系统命名应该被非遗传学健康专家和试验结果的其他特定用户理解。实验室应该紧跟分子遗传学专业术语发展的步伐，而且在新术语成为标准实践之前，可能需要同时使用新的和从前的（或者传统的）术语。
（2）试验报告目录
        分子遗传学试验报告应该包括：病人身份、申请专家姓名和联系方式、与检测结果相关的病人信息、执行的检测和使用的方法、原始样本类型、样本接收日期、实验室名称和地点、试验结果、临床意义、批准报告的人的身份、实验室联系信息、发出报告的日期等等。
（3）发布和报告分子遗传学试验结果
        因为病人其他家庭成员的遗传学信息可能被包含在试验报告内，当发送或访问报告时，应适当的注意保持家庭信息的保密性。应该有过程来监视意外透露和记录这类事件的纠正措施。
（4）检验后实验室咨询和遗传咨询
        实验室应该能够给它提供的试验报告上的任何基于试验结果的建议提供咨询，例如病人和/或有风险家庭成员的遗传咨询，可能对病人有用的附加试验，为了更好的为病人解释结果对病人家庭成员进行附加检测和提供有风险家庭成员关于此疾病的检测。
（5）记录和报告的保留
        相关报告和记录的不同的准则和建议包括处理储存时间和储存方法，安全和保密性，以及可到达与可恢复性。
（6）已检测样品的保留
        原始的或者任何相关引生出的样品（例如，提取的核酸）应该依据普遍的法律和准则来保存 。
5. 保证病人检测质量
        实验室应该有过程和程序来评估和保证其检测程序和服务活动的质量，包括EQA机制和它的质量管理体系的其他有机组成部分。
四、人员资格，责任和能力
        质量体系要素中人员的主要过程是：人员管理计划，人员资格和描述，招聘和保留计划，任职培训，训练，能力评估，继续教育。
        对于实验室操作的规定方面指定人员，包括负责全部实验室管理的人员(实验室负责人)，负责检测技术和科学监督（技术主管），与实验室顾客交流实验室服务和试验结果（实验室负责人和/或临床咨询员），日常监管（常规监督者）和执行全部检测和质量管理程序（检测人员）。
参考文献
[1] CLSI.MM20-A—Quality Management for Molecular Genetic Testing; Approved Guideline.
                                       摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第九期
                                                                编辑：范伟伟