冰冻混合人血清酶学标准物质研制进展

狐仙

1 标准物质的概念及用途
       标准物质是一种材料或物质,是参考测量系统的重要组成部分。正如ISO一系列指南中指出的,标准物质用于校准测量系统、评价测量程序或为材料赋值。按照测量标准的不同,标准物质分为一级标准物质、二级标准物质、校准物、质控物等。一级标准物质是具有最高计量学特性的标准物质,其值由一级参考测量程序确定。一级标准物质是测量单位的具体体现,一般为高度纯化的被分析物,用于校准二级参考测量程序。二级标准物质由一种或多种二级参考测量程序定值,一般是与实际临床样品基质相似的物质。可见二级标准物质是临床检验试剂生产和使用中建立溯源性的主要角色。而一级标准物质则主要在参考实验室中使用。有证标准物质(CRM)是附有证书的定值标准物质,在证书中对该标准物质的每个特性以一定的格式进行说明。有证标准物质一般情况下是较高级别的标准物质,主要用于量值传递。
       随着临床实验室酶学标本检测量的增加,酶学标准物质的需要量也相应大量增加。根据参考品使用目的的不同,可以选用不同的原料来制备。作为校准品,最好选用人工合成的原料,因为这种原料的性质和成分都是已知的,作为校准品应具有较小的不确定度；作为质控物质,最好选用天然的物质,与待测标本最好具有尽可能的相似性,否则将不具有充分的代表性。作为质控品的酶在不同的常规方法与参考方法之间应具有充分的互换性(commutability),考虑到互换性,酶标准品应采用与实际样品相同的物质作为原料。因此酶学标准物质最好为人源血清标本,虽然其存在来源有限和具有潜在传染性等缺点。用冰冻人血清制备标准物质的可行性已得到了广泛的认同。
2 血清酶学标准物质研制及其进展与发展概况
       60年代,Browen等首先研制了生物参考样品。70年代,各种生物材料标准物质的研制和使用得到迅速发展,当时美国国家标准局已制备了多种生物标准物质,为推动酶学标准物质的研一定的基础。进入80年代,标准物质在世界范围内普遍推广和使用。欧洲共同体标准局[(BCR),现为欧共体标准物质与测量研究所(IRMM)]和美国国家技术研究院已经研制出了某些酶的一级标准物质,即酶的有证参考物质(CRM),其特点是这些标准物质的值都有溯源,且每个经过验证的值都附有规定置信水平的不确定度。这些CRM的值均是采用IFCC 推荐方法确定的活性,反应温度为30℃。90年代后期,IFCC 决定将所有酶学参考方法的温度修改为37℃,相应的有证标准物质随即推出,见表1。日本临床检验标准委员会(JCCLS)也建立了本国的CRM,其CRM为含有8种酶的混合参考品,这点与欧洲每瓶中仅含有一种酶不同,而且其除LDH取自人红细胞外均为重组人源性产品。
       国内生物材料标准物质的研究与应用始于80年代,到现在已经研制出临床化学分析与药品成分分析类国家标准物质80多种。生化酶学方面,国内已经建成了数个酶学参考实验室,AST、ALT、AMY、GGT、CK、ALP、LDH等几种酶的参考方法基本建立,利用冰冻混合人血清研制酶学标准物质的工作进展顺利。2006年国家科技部“863”计划将体外诊断试剂及参考物质列入专项,项目的目标之一是研制16 个临床生化标准物质,包括7个酶学标准物质、7个无机离子标准物质和2小分子代谢物标准物质。该项目在2010年结题。据了解目前该项目进展顺利,能为临床常见的酶学测定提供较完善的国家二级标准物质。
3 冰冻混合人血清酶学标准物质制备流程
       冰冻混合人血清酶学标准物质的制备包括以下几个关键步骤：标本收集、均匀性检验、稳定性检验、定值方法,标示值和不确定度评价、互换性研究、溯源性评价。David L教授等认为当有两个或者更多的有证参考物质传递同一量值时,必须进行可比性验证,这可以确保使用者能够更好达到校准测量系统或验证测量程序的目的。
3.1 标本的收集
       用于制备参考物质的血清原料的收集,必须完全遵照相关的国际文件,如ISO指南34及WHO的相关指南,包括HIV病毒和肝炎病毒的检测。除外HIV病毒和肝炎病毒阳性的标本。
3.2 均匀性检验
       均匀性是标准物质的基本要求之一,冰冻混合人血清也需要检查均匀性,均匀性包括瓶间均匀性和瓶内均匀性。至于瓶内均匀性,因为冰冻血清溶化后为液体,可以通过摇动,使瓶内物质血清均匀,故一般不须检测瓶内均匀性。瓶间均匀性检验有两种方式,即ANNOV方式和替代方式。ANNOV方式是抽取有代表性的样本数,每瓶重复测量2～3次；替代方式是每瓶测量一次,选一瓶重复测量n次。ANNOV方式较常用,可以得到较多的数据；替代方式目前较少使用。瓶间均匀性检验必须考虑测量的方法、抽样方法、抽样数量、取样量、测量顺序等对结果的影响,以及测量结果的数据分析。
3.3 稳定性研究
       只有证明充分均匀之后才能进行稳定性检验。而任何样品(只要不小于均匀性检验所用的取样量)都可以认为具有代表性。对所需样品的数目没有限制,也不要求随机取样。然而,由于测量技术的重复性和精密度中间精度的影响,结果会有变化,因此应当进行重复测试。由于标准物质的稳定性直接影响对结果的判断,因此国际组织对这一问题一直非常重视。对于不同生物标准物质的稳定性参数设定更为复杂。WHO 2004版修订的指导方针在提到稳定性研究时,指出应用统计学分析帮助确定制品的储藏条件、运输条件和在实验室中如何使用。生物标准物质研制过程中应进行加速破坏试验,根据制品性质存放不同温度(一般放4℃、22℃、37℃和-20℃)、不同时间,进行活性或效价测定,以评估其稳定性。标准物质建立以后,应定期与国际标准物质进行比较,观察活性是否下降,作实际时间监测分析。
       G.M.HENRIKSEN等研究表明,在-80℃条件下,从1997年到2003年长达5年间血清中ALT、Albumin、Bilirubin、Calcium、Chloride、Cholesterol、CK、Creatininium、GT、Glucose、Magnesium等检测项目值未发生明显变化。G.M. HENRIKSEN 准备连续观察ALT长达10年,至今尚未完成。Uldall A等也进行过类似的研究,表明冰冻混合人血清在-80℃条件下,预期的稳定性至少能达到五年甚至更长时间。
3.4 冰冻混合人血清的赋值
       3.4.1 定值方案 根据ISO Guide 35,为冰冻混合人血清赋值方案主要有以下几种：一是由独立的实验室(可以包含几个独立的实验室)采用单独一个基准(定义)法,最好是双份测量；二是由一个独立实验室采用二个或二个以上独立的参考方法。这些方法应有较小的测量不确定度,其测定结果应被其他的方法或实验室验证；三是由多个具有资质的参考实验室构成参考实验室网络,它们采用的已证明准确度的参考方法,而且评定了已知和可接受的测量不确定度；四是采用特定方法的方式(实验室间研究),只给出用特定方法评定的特性值。比较常用的方式是,由几个独立工作的合作者,采用一种以上的方法(每种方法的准确度、重复性和复现性都已很好地进行了确定)共同测定特性值,这时特性值能够被可靠地确定。
       3.4.2 不确定度评估 在定值的每一个关键步骤都要进行不确定度评估,不确定度可能来源包括：测量结果的可重复性、CRM纯度、标准物质质量、天平的精度、容量瓶体积、移液器体积、pH计的精度、分光光度计精度、环境条件、操作人员变更等。上述涉及的仪器和器材须经权威部门校准和认证并定期通过实验室内部校准。
3.5 冰冻混合人血清互换性研究
       作为参考品的酶在不同常规方法与标准方法间要有互换性(commutability)。互换性是指酶参考品在常规方法与标准方法间与人血清中酶有相同的反应特性。只有具备互换性的酶制品才能将不同方法测定的结果转换成标准方法测定的结果,因此,互换性在酶测定方法标准化中具有决定性的意义。
3.6 冰冻混合人血清定值的溯源性
       溯源性(traceability)是指通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性。ISO 15189：2003文件中的5.6.3指出：应设计并实施一套对测量系统的校准,真实性的检定程序以保证测量结果可溯源到SI 单位,或可参比到一个自然常数或其它规定的参考值。如果以上都无法实现,还可采用参加适当的实验室间的比对计划使用相应的标准物质(有证书说明其材料的特性)将供应商或制造商提供的关于试剂程序或检验系统的溯源性的说明形成文件等。ISO在溯源性上的目标是改进空间和时间上的试验结果的可比性。
4 结语
       利用冰冻混合人血清研制酶学二级标准物质(标准物质),甚至一级标准物质(标准物质),原料无基质效应,均匀性良好,稳定性可靠。具有溯源性,定值稳定,不确定度在可接受范围内,具有充分的互换性。冰冻混合血清是制备酶学标准物质的较为理想的原料。在参考测定程序、标准物质、参考实验室组成的参考测量系统中,标准物质也许仍然是溯源性链条上最薄弱的一个环节。加之当前国内常规实验室血清酶测定结果的溯源性相对较差,冰冻混合人血清参考品的研究开发在国内尤其必要。利用冰冻混合人血清尽快地研制出酶学标准物质,对推动酶学的标准化进程,进而提高人民的健康水平意义重大。   
                                                                                                                                 编辑：范伟伟

medstd

有吸引力，回复看看