应重视糖化血红蛋白测定技术及量值溯源

山泉

糖化血红蛋白(glycated hemoglobin，GHb)是葡萄糖与Hb的结合产物，用来衡量RBC中与葡萄糖结合的Hb的含量。人类Hb是由2对(4条)Hb单体聚合而成，成人Hb由HbA(97．0％；2a，2B)、HbA2(2．5％；2d，28)和HbF(0．5％；2ct，2Y)组成?。GHb的主要成分HbAlc(目前临床上所称的GHb)是在组织中由葡萄糖的游离醛基与HbA的B链N末端缬氨酸的氨基经非酶促结合反应，先形成不稳定的Schiff碱(醛亚胺)，然后经过Amadori重排，形成稳定的酮胺化合物HbAlC，此反应速度非常缓慢，一旦形成不再解离，这种不可逆的、非酶催化的反应称为糖基化；主要取决于血糖浓度及血糖与Hb的接触时间。可以反映最近2—3个月的平均血糖水平。2002年美国糖尿病学会(American Diabetes Association，ADA)明确规定糖尿病患者应定期检测HbAlC，并将其作为监测糖尿病血糖控制的“金标准”；1993年ADA作出结论报告：长期患糖尿病者常伴发微血管、大血管(心脑血管、肾、视网膜及神经等)病变。
一、GHb的测定
      GHb的测定方法有几十种之多，目前常用的基本上可分为两大类：一类是基于GHb与Hb的电荷不同，如离子交换层析法、电泳法；另一类是基于Hb上糖化基团的结构特点，如亲和层析法、免疫法、离子捕获法和酶法等。
      1．离子交换层析法：基于不同组分带电荷不同进行分离，糖化导致Hb分子表面阳离子丢失。在弱酸性的阳离子交换树脂中，在低浓度洗脱液的离子强度和中性pH条件下，GHb几乎不带正电荷，从而在Hb前先洗脱，此现象即是GHb最初的术语“快速血红蛋白”。而HbA带正电荷，再用高浓度洗脱液将其洗出，得出Hb层析谱，HbAlC值通过HbAlC面积占总Hb面积的百分比来表示。主要有离子交换HPLC法和手工微柱法，常规的离子交换HPLC方法分离GHb可以达到临床需求的精密度和稳定性，所以美国国家糖化血红蛋白标准化计划(National Glycohaemoglobin Standardization Program，NGSP)将其作为参考方法；手工微柱法的干扰因素很多，尤其是对pH值和温度的变化敏感，HbF及变异血红蛋白(HbS、HbC、HbE等)对结果有干扰，干扰程度根据柱的分离能力而定，所以，一定要仔细观察图谱。
      2．亲和层析法：硼酸具有与整合在Hb分子上葡萄糖的顺位二醇基作可逆结合反应的性质。经常使用的是间一氨基苯硼酸琼脂糖，将血样本加到层析柱后，所有的GHb(HbAl旁链糖化的Hb即总GHb)与硼酸结合，而非GHb通过层析柱可测量；再加入高浓度也包含顺位二醇基的多羟基复合物，例如：山梨醇、GHb与硼酸的结合被替换而被洗脱下来，亲和层析法对变异血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对其他方法不敏感，但测定的是GHb总量。
      3．免疫法：利用抗原、抗体反应的原理进行测定。GHb的13链N末端提供了一个容易被抗体识别的抗原表位，可以用单克隆抗体或多克隆抗体，特异识别GHb[j链N末端最后4～6个氨基酸组成的抗原表位，结合比色或比浊法，以糖化蛋白为标准，测定HbAlC的含量，再测定Hb的含量，最后计算出HbAlc占总Hb的百分数。需注意的是，目前的免疫化学实验不仅检测HbAlc，也同时检测HbA2c，因为HbA2糖化8链的表位是相同的；高浓度样本检测结果偏低，这与抗体浓度不能达到相关高度有关，需要稀释；另外，现在研究发现还有HbS、HbC、HbE和HbF等变异血红蛋白可影响检测结果；因此，此类方法只能作为判断糖尿病血糖水平的指标，不可用于变异血红蛋白的研究。
      4．离子捕获法：该方法是近几年发展起来的新方法，采用自动分析仪，其原理是用荧光标记GHb与相应抗体结合物，测定其荧光强度，从而得到GHb的浓度，此方法适用于批量标本的检测。
      5．电泳法：该方法是利用在电场中GHb和非GHb所带电荷不同，从而等电点及泳动速度不同进行分离检测，此方法还可将Hb变异体分离，但一般电泳法速度慢，精密度不太好，目前尚无具有批量样本检测能力的商品化仪器。
      6．酶法：将全血制成溶血液，用特异蛋白内切酶将血红蛋白酶解消化成果糖基氨基酸，果糖基氨基酸在果糖基氨基酸氧化酶的作用下产生过氧化氢(H：02)，H：O：的浓度与血液中GHb的含量呈正比，H：O：在过氧化物酶催化下与色素原指示系统反应，根据颜色变化程度可得H：O：浓度，从而得知样本中GHb的含量，并同时测定同一管消化液的总Hb浓度，计算GHb和Hb的浓度比值即为Glib结果。此技术的应用对GHb的测定是个突破，表现在3个方面：(1)发展了特异蛋白内切酶特异酶解血液中的Hb产生果糖基氨基酸，血浆中的其他蛋白，如白蛋白、球蛋白等对结果不能产生干扰；(2)发展了果糖基氨基酸氧化酶，只在特定的蛋白酶体系与果糖基氨基酸反应；(3)在溶血液体系中应用了H：O：测定的灵敏性，由于过氧化氢酶可以分解色素元引起负反应，所以用过氧化物酶替代之。此法提供了一个像临床生化反应一样快速、均一的反应系统(如葡萄糖、谷氨酸氨基转移酶)，有很好的精密度，变异系数(cv)可以为l％，与常规HPLC法和免疫测定法有很好的相关性，可以提供一个具有可比性且更精确的GHb结果，不需要昂贵、专用的仪器。由于HbAlc测定的准确性直接关系到临床治疗效果，而实验室中常用的HbAlc测定方法因所用原理、方法不同，所测组分(HbAl或HbAlc)有差异，加上变异血红蛋白(HbS、HbC、HbE和HbF)的影响，国际上有许多关于I-IbS、HbC、HbE和HbF等对不同厂家、同一厂家不同型号仪器测定结果影响的研究报告，NGSP对此进行了归纳总结并于2007年11月公布在其所属的网站上(http：／／www．ngsp．ors／pros／index．html)，使得测定结果的准确度、重复性、甚至样品的稳定性都有所差异归J，导致各实验室之间结果有较大差异，更谈不上可比性和溯源性。如果能统一标准物质，建立认证体系，定期进行质评活动，可提高临床实验室测定结果的可比性和准确性。
二、国际上GHb测定的量值溯源及标准化进程
      为解决可比性和溯源性问题，1996年美国临床化学协会(AACC)建立了全国糖化血红蛋白标准化计划，NGSP以胆固醇参考法实验室网络项目为样板，建立了由执导委员会执导下的实验室网络，实验室网络包括管理核心、中心参考实验室、一级参考实验室和二级参考实验室。管理核心负责分析全部网络数据，向合格的实验室和厂家颁发证书。中心参考实验室采用参考方法测定HbAlc，以建立基准，一级参考实验室必须与中心参考实验室采用相同的方法，确保实验结果可溯源到中心参考实验室。二级参考实验室可以使用其他的方法，但必须保证实验结果可溯源到中心实验室，参考实验室直接参与生产厂家的校准。NGSP要求所有出厂方法每年要申请糖尿病控制和并发症试验(DCCT)实验室认证，到2000年此项工作取得了极大的进展，90％的实验室以HbAlc报告GHb结果，各实验室间的CV小于5％，所有检测方法的HbAlc结果与NGSP靶值的偏差小于0．8％，目前美国大多数实验室的报告结果都能溯源到DCCT／英国糖尿病前瞻性研究(UKPDS)结果uo|，NGSP每年都要在其网站上公布当年得到认证的生产厂家方法和试剂，2008年1月公布了今年得到认证的生产厂家方法和试剂。
      由于没有国际统一公认的参考物质和参考方法，1995年国际临床化学组织(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine。IFCC)建立了HbAlC标准化工作组，研发测定HbAlc的参考物质和参考方法，经过几年的探索，IFCC确立了测定HbAlc的参考方法，即先用盐洗新鲜的全血样本，以去除不稳定的Schiff碱，用国际血液学标准化委员会(ICSH)参考方法准确测定溶血液的Hb浓度，然后用Glu-C蛋白内切酶和消化液将溶血液及标准物质HbAlC、HbA0(IRM彬IFCC466，467)混合物配制的标准液分别同步水解为多肽，得到糖基化和非糖基化的B链N末端六肽片段，用高效液相．电喷雾电离质谱(HPLC-ESI／MS)或高效液相．毛细管电泳(HPLC．CE／UV)方法分离、测量，由于已知糖基化和非糖基化的B链N末端六肽片
段的质荷比值(M／Z值)，根据响应信号比例计算出糖基化的B链N末端六肽片段比例、含量，从而得出HbAlc在样本中所占的百分比；以高度纯化(>98．5％HbAlc，>99．5％HbA0)的HbAlC和HbA0标准物质混合物为标准，对方法进行校准。此方法已经由包含欧洲、日本和美国的11个IFCC国际参考实验室网络评估，结果显示：两个方法的结果相同，相关系数(r)为1．000；室内CV为0．47％一2．07％，室间CV为1．35％一2．27％In]。由于以接近纯品的HbAlc和HbA0为标准，使得该参考方法有极高的特异性，因此结果比目前的商业方法检测的结果偏低，也低于NGSP的结果，大概低1／4，如果用百分数来表示的话，NGSP的6．0％、7．0％和8．0％将分别为4．2％、5．3％和6．4％。
      2007年11月，HbAlc和HbA0的有证标准物质已经由比利时参考物质与测量研究所(IRMM)提供商品，该标准物质分别由糖尿病患者及健康志愿者提供全血，经过离子交换HPLC、亲和层析HPLC、2D电泳、HPLC．ESI／MS及肽图谱(peptide mapping)等技术进行多步分离、纯化，分别得到>98．5％HbAlc和>99．5％HbA0的标准物质，由3个参考实验室(1个使用HPLC—CE／UV方法，2个使用HPLC—ESI／MS方法及ICSH血红蛋白参考测定方法)给出HbAlc和HbAO及Hb浓度的精确定值。2个标准物质的混合物可以为参考方法校准。
      为探讨IFCC结果与其他标准化计划组织结果之间的关系，2001--2003年美国NGSP、日本糖尿病学会(Japanese Diabetes Society，JDS)／日本临床化学学会(Japanese Society of Clinical Chemistry，JSCC)和瑞典临床化学学会(Swedish Society for Clinical Chemistry，SFKK)的几十个参考实验室参加了这项工作。研究结果表明，IFCC结果与其他结果有非常确定的关联，可用换算公式表示为：NGSP．HbAlc=0．915(IFCC．HbAIc)+2．15％(R2=0．998)；JDS／JSCC．HbAIc=0．927(IFCC—HbAlc)+1．73％(R2=0．997)；Swedish．HbAlc=0．989(IFCC—HbAlc)+0．88％(R2=0．996)。值得注意的是，此方法仪器昂贵，操作复杂，目前只用于HbAle测定的标准化，还不能广泛应用于临床实验室。
      随着新参考方法及一级标准物质的确立，HbAlc结果标准化巳提上议事日程，2007年IFCC重新明确了HbAlC的命名、性质、单位：(1)全称为B链血红蛋白一B链N末端脱氧果糖基血红蛋白，在口语或报告中可以使用“脱氧果糖基血红蛋白”；(2)特别强调HbAlc测定的是“物质分数”，而不是“质量分数”；(3)推荐使用“mmol／mol”作为HbAlC的单位，此建议为HbAlc结果数据提供了非常明确的计量溯源到溯源链的最高等级国际单位制(SI)。新的命名、性质、单位将输入IFCC·IUPAC数据库取代原有的命名、性质。新单位的使用，使原来的％(=10。2)被mmoL／mol(=10。)取代，例如：3．4％将成为34 mmol／mol，由于数值没有重叠区域，这样，在同时报告HbAlc和平均血糖时，就可以与同是使用国际单位(retool／L)的血糖区分开，如：血糖数值为3．4，避免误读。
      新参考方法的出现不仅标准化了HbAlc结果，也标准化了由此衍生并计算的平均血糖，导致了世界范围内HbAlc结果报告的改变。为达成共识，2007年5月在意大利举行会议，由ADA、欧洲糖尿病研究协会(European Association for the Study of Diabetes，EASD)、国际糖尿病联合会(International Diabetes Federation。IDF)和IFCC一致提出共同协议，内容如下：(1)HbAlc检测结果将在世界范围内标准化，包括参考系统和结果报告；(2)新的IFCC HbAlc参考系统只可用来实现测量标准化；(3)将在世界范围内用IFCC单位(mmoL／m01)和NGSP单位(％)共同报告HbAI c结果；(4)如果“平均血糖研究”完成其特定标准，那／z,要同时报告由HbAI c衍生并计算出的平均血糖(AIc—derived average glucose，ADAG)值，作为解释HbAIc的结果；(5)临床糖化控制目标的指导方针应该由IFCC单位、NGSP单位和ADAG共同表达。所有组织一致同意并将尽快在全球贯彻执行，相信此协议会进一步实现世界范围内HbAIc结果的可比性，同时为临床医师与患者进行沟通提供了更好的平台，使患者得到更适合的治疗。
三、我国GHb测定现状
      目前，国际上有3个国家标准：美国的NGSP，日本的JDS及瑞典的SFKK，全世界有97％的实验室采用NGSP标准。尽管国际上GHb测定的标准化工作进行了多年并在参考方法、标准物质、监测治疗界值、测定方法及数据转换公式达成共识，但我国GHb测定还处于起步阶段，据我中心室间质评统计结果表明：同一方法实验室间的cv在10％甚至20％以上，距离国际上5％的标准还有很大的差距，使得GHb作为糖尿病筛选、诊断、血糖控制、监测疗效及预防慢性并发症的绝对指标大打折扣。由于糖尿病发病率在我国呈逐年上升趋势，对人民健康危害极大，我国又是人口大国，患病的绝对人数多，因此，理应重视量值溯源，统一标准物质，建立参考系统、网络实验室及认证体系，定期进行质评活动，以提高GHb测定的准确性。