取样方法的比较及其对龈沟液酶水平的影响

财小弟

　　【摘要】　目的　观察重复取样后两次样本的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)水平的变化，比较袋口和袋内两种取样方法。方法　分别用袋口和袋内法间隔20min重复取龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)样本， 并测定其中的ALP水平。 结果　两种方法取样示，20min后的ALP水平与第1次相比差异无显着性(P>0.05); 袋内法获得的ALP水平明显高于袋口法(P<0.001); 重复取样后，多数位点ALP水平不能完全恢复，但袋内法略优于袋口法，用酶总量表达略优于用浓度表达。 结论　重复取样的间隔期宜超过20min; 建议用袋内法取样测定ALP水平并以酶总量表示为佳。
  　　【关键词】　碱性磷酸酶　　取样方法
  　　近年来用不同方法对龈沟液(gingival crevicular fluid, GCF)中细菌产物、宿主来源的酶及抗体、细胞因子等多种成分的研究，揭示了宿主反应在牙周组织局部的表现，对牙周疾病病因机制的阐述及监测牙周炎的发生、发展、指导临床治疗均有重要意义。一般常用滤纸条在袋口或袋内取GCF，但均满足不了多项生化指标综合评价的需要，从而影响对牙周炎活动期的判断和预测。重复取样则可将多次重复采取的样本混合形成一个牙位的一份GCF储池，或者各重复采取的样本进行多成分或一种成分的多方法分析,既扩大了样本量，避免了牙位特异性的影响，又便于研究各成分的交互作用。GCF中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)与牙周组织的活动性破坏密切相关，用袋内法重复取样后有能恢复到取样前水平的趋势，但样本量太小［1］。用袋口法对ALP重复取样尚未见报道。我们分别用袋口法、袋内法间隔20min重复取样，比较两次样本的GCF-ALP水平的变化，以期找到重复取样的较短间隔期，并对两种取样方法进行比较。
  

　　材料与方法

  　　1. 病例选择： 从北京医科大学口腔医学院牙周科初诊患者中选择成人牙周炎（adult periodontitis, AP）和快速进展性牙周炎（rapidly progressive periodontitis， RPP）患者， 每人选择4～10个不相邻的邻面牙周炎位点（探诊深度≥4mm）。上述患者均身体健康无系统性疾患，1年内未做过牙周系统治疗，3个月内未连续服用抗生素3天以上， 妇女未妊娠。袋口法：共17例患者，男10例，女7例；其中AP14例，RPP3例，年龄19～64岁，平均43.1岁，共100颗牙，100个位点。袋内法：共17例患者，男8例，女9例；其中AP13例， RPP4例，年龄20～65岁，平均41.4岁，共102颗牙，102 个位点。
  　　2. 临床指标：①菌斑指数(plaque index, PLI），用Silness&Le法；②出血指数(bleeding index, BI）， 用改良Mazza法；③探诊深度(probing depth, PD），用Michigan O牙周探针检查。
  

  　　3. GCF的收集及测量：取样部位隔湿、吹干，去除龈上菌斑并记录PLI，袋口法取样者将专用滤纸条(Periopaper, Proflow, USA)轻轻插入龈缘下方≤1mm处；袋内法则将同样的滤纸条轻轻插入牙周袋内，至有轻微阻力为止。两法均留置30s后取出，用龈沟液测量仪Periotron 6000测定GCF量，即刻放入Eppendorf管密封。20min后在同一牙位同法取样、定量，将滤纸条放入另一Eppendorf管密封。弃去带血样本。将装有GCF样本的Eppendorf管于-70℃贮存待检。
  　　4. GCF-ALP的测定：样本于室温下解冻，每管均加入80μl 缓冲液（0.05mol/LTris-HCl，pH8.0）震荡1h，再于4℃、10 000r/min离心10min，取上清液，用Beckman 全自动生化检测仪测定ALP的浓度（IU/L）。
  

　　结果

  　　1. 经χ2检验，袋口组与袋内组患者相比，其性别、AP和RPP的构成比均无统计学差异(P>0.05)；经t和t′检验，两组患者的年龄、临床指标亦无统计学差异(P>0.05)。
  　　2. 经Mann-Whitney检验， 用袋内法取样时，第1次和第2次样本的GCF-ALP均值水平(总量和浓度)都比用袋口法取样时显着升高(P<0.001)。详见表1。
  　　3. 配对秩和检验表明， 无论用袋口法还是袋内法，间隔20min重复取样，前后两次样本的GCF-ALP均值水平(总量和浓度)均无统计学差异(P>0.05)。见表1。
  　　4. 多元回归分析表明， 重复取样后，用酶总量表示时，袋口法取样仅12%的位点ALP有可能恢复到取样前的水平，袋内法取样仅36%的位点有可能恢复到取样前的水平。用浓度表示时， 袋口法不存在回归关系， 而袋内法仅有31%的位点能恢复到取样前水平。经χ2检验，袋内法重复取样，ALP总量能恢复的位点数明显多于袋口法重复取样(P<0.001)，而与ALP浓度能恢复的位点数比较则无统计学差异(P>0.05)。见表2。
  

  <P>　　*ALP浓度的回归分析，**袋内法与袋口法比较，***袋内法的ALP浓度与ALP总量比较；百分比代表两次样本ALP水平可能相一致的个别位点占样本总位点的百分比