抗磷脂抗体谱的临床应用和规范检测

晨曦

作者：张蜀澜 李永哲
单位：中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院风湿免疫科　风湿免疫病学教育部重点实验室

抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome, APS)是一组以动静脉血栓形成和(或)反复性流产与血小板减少为主要临床表现，以抗磷脂抗体(antiphospholipid antibodies, aPLs)为主要血清学指标的自身免疫性疾病。APS临床表现复杂多样，可累及全身多个器官和系统，故对该病早期诊断以及及时治疗尤为重要。aPLs是APS的重要特征之一，在2006年修订的APS诊断标准中，明确将aPLs的检测纳入APS诊断标准[1]。随着近年来抗凝血酶原抗体(antiprothrombin antibodies, aPT)、抗膜联蛋白A5(anti–annexin A5 antibodies, aANX A5)抗体等新的aPLs的发现，以及化学发光法[2]、免疫微球法等新的检测方法的应用，不断促进了对APS发病机制、临床复杂性以及aPLs临床意义的深入认识。

一、抗磷脂抗体谱

1．抗磷脂抗体的认识过程：

aPLs是一组异质性抗体，其靶抗原为磷脂、磷脂结合蛋白，以及磷脂–磷脂结合蛋白复合物。对于aPLs的最初认识来源于1906年Wasserman等建立的梅毒血清学检测方法。通过这一方法人们发现系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)患者的血清可与从先天性梅毒胎儿的肝脏乙醇提取物中的抗原发生反应，这种抗原后被证实为心磷脂。这种现象也被称为梅毒血清反应生物学假阳性。1952年，Conley和Hartmann等首先在SLE患者血浆内发现了狼疮抗凝物(lupus anticoagulant, LA)，随后抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibody，aCL)的固相放射免疫法及ELISA法等检测方法的建立，以及抗β2糖蛋白I抗体(anti–β2 glycoprotein I，aβ2GPI)的发现，推动了人们对于这一类疾病的认识。1985年，Hughes等[3]提出了抗磷脂综合征这一概念。1999年初次建立了APS的初步诊断标准(札幌标准)[4]，并于2006年对该诊断标准进行了修订，将αβ2GPI纳入诊断标准[1]。

2．抗磷脂抗体谱：

最初认为aPLs只识别带负电荷的磷脂，而随着多年来研究的深入，发现了针对不同抗原特异性的aPLs。根据其抗原特异性可分为如下几类：(1)阴性磷脂：例如心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇等；(2)中性磷脂：例如磷脂酰胆碱；(3)两性磷脂：例如磷脂酰乙醇胺；(4)磷脂结合蛋白：例如β2糖蛋白Ⅰ(β2glycoprotein Ⅰ，β2GPI)、凝血酶原、膜联蛋白A5、蛋白C、蛋白S等，见表1。值得注意的是，虽然APS的诊断标准中仅纳入LA，以及IgG及IgM型的aCL和aβ2GPI，但是多项研究指出除这些抗体外的aPLs有助于"血清学阴性"的APS患者的诊断[5]。然而，这些aPLs与APS的临床表现之间的相关性仍存在争议，亟需更多的研究数据支持。目前的研究显示抗凝血酶原/磷脂酰丝氨酸抗体及抗β2GPI结构域1抗体与血栓形成和病态妊娠强相关[6]。

抗磷脂抗体谱的临床应用和规范检测

3．LA、aCL与aβ2GPI的关系：

aCL是目前临床应用最广泛、阳性率最高的aPLs。然而特异度较差，特别是低滴度的aCL。aβ2GPI的特异度高于aCL，与血栓形成及病态妊娠的相关性强于aCL，但灵敏度低于aCL。LA是唯一真正反映凝血功能障碍的指标，特异度高于上述两2个指标，并且根据澳大利亚皇家病理家学会的室间质评结果来看，不同实验室的LA的检测重复性优于其他指标。根据本实验室的数据显示[7]LA、aCL与aβ2GPI的检测结果并不完全一致，在疑似APS的SLE患者中有30%的患者仅有1种抗体阳性。因此，同时检测3种抗体可起到互为补充的作用。

二、抗磷脂抗体谱的临床价值

1．APS的诊断及鉴别诊断：

2006年悉尼修订分类标准中规定，APS患者至少有1项中到高滴度的aPLs[LA、IgG型和(或)IgM型aCL或IgG型和(或)IgM型aβ2GPI]阳性，而且其结果必须相隔12个周以上有两次或两次以上阳性才能初步诊断[1]。APS依据病因可分为原发性和继发性。原发性APS即APS单独发生，不合并其他自身免疫性疾病，而继发性APS是指APS合并其他自身免疫性疾病一起发生。但目前认为应采用APS合并其他疾病取代继发性APS的诊断。APS常与自身免疫性疾病合并，约40% SLE患者aPLs阳性，其中10%～20%的患者最终发展为APS[8]。APS的临床表现复杂，虽然多数患者符合分类标准，但仍有部分具有典型临床表现的"血清学阴性"患者由于现有血清学指标的局限性而难于诊断。此外，aPLs还可见于无临床症状的肿瘤、感染性疾病、药物治疗和10%左右的健康人群[8]。这部分人群常常可能携带aPLs，抑或可能在将来发展为APS。上述因素都造成了对于APS诊断的极大困扰。

APS患者临床表现以动静脉血栓形成及产科表现为主，并且血管栓塞可累及全身各个系统。另外，部分患者的临床首发症状可表现为血小板减少、溶血性贫血、网状青斑或是与APS相关的神经精神症状，如舞蹈病、癫痫等。因此，多数初诊患者常常就诊于血管外科、产科、神经内科、肾内科、皮肤科、血液科甚至急诊科等各个专科。然而，由于各个专科对于APS认识的不足，常可能导致APS患者诊治的延误。综上，虽然2006年推出了APS的分类诊断标准，但该疾病对于我们仍然是一个比较新的领域，推广及加深各个专科对于APS的认识势在必行。

2．血栓及病态妊娠风险预测：

依据分类标准，APS患者可分为4类，1种以上aPLs阳性为Ⅰ类，任意1种aPLs阳性为Ⅱ类(Ⅱa为LA，Ⅱb为aCL，Ⅱc为aβ2GPI)。3种aPLs均为阳性，且为中到高滴度，对于血栓及病态妊娠风险的预测价值最高。Ⅱ类APS患者发生血栓及病态妊娠的风险最低。研究发现，LA是最具有预测价值的指标，其抗凝活性可由aβ2GPI或抗凝血酶原抗体(anti–prothrombin antibodies，aPT)所介导。β2GPI依赖的LA的预测价值高于PT依赖的LA。aCL单独阳性并不与血栓或病态妊娠的风险增高相关，而aβ2GPI由于标准化程度低，其预测价值尚不明确。通常认为高滴度抗体的临床预测价值更高，例如高滴度aPLs(临界值3倍以上)或3种aPLs均阳性时提示患者发生血栓或病态妊娠的风险最高，患者应根据临床表现考虑长期高强度抗凝治疗。然而也有研究显示aPLs持续低滴度阳性的女性中病态妊娠发生率高于正常女性。

APS的临床表现常与IgG型aPLs相关，IgM型aPLs单独阳性较为少见，但也有文献报道在病态妊娠的患者体内长期单独存在IgM型抗体[9]。然而如果患者IgG型和IgM型抗体同时阳性则与血栓或病态妊娠的相关性更强。虽然体外研究发现IgA型aβ2GPI介导了血栓形成的机制，然而IgA型aPLs与APS临床风险的相关性仍存在争议。有文献报道IgA型aβ2GPI常常伴随APS临床症状出现，并且22%的恶性APS患者中仅IgA型抗aβ2GPI阳性。在第13届抗磷脂抗体国际大会中，专家建议在有APS的临床表现而高度怀疑APS，而IgG型和IgM型抗体均阴性的患者应检测IgA型抗体[1]。

三、抗磷脂抗体谱规范检测

1．抗磷脂抗体检测的标准化：

目前aPLs实验室检测方法学的准确性和临床应用仍然存在很多争议，即不同试剂和方法学对aPLs的影响性较大。通常高滴度aCL的一致性好于滴度接近临界值的aCL。一项多中心的研究显示，5种不同来源以及不同方法学的aCL和aβ2GPI抗体检测试剂(包括ELISA法和化学发光法)间的一致性较差[2]。因此，迫切需要实现aPLs检测的标准化。

LA检测的标准化：根据国际血栓与止血学会标准化委员会的建议[10]，LA的检测应遵循一下几点：(1)LA的初筛实验应采用两种方法，通常采用改良的Russell蝰蛇毒稀释时间(Dilute Russell′s viper venom time, dRVVT)作为第1项检测，以敏感性较好的活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)作为第2项检测，使用2种或2种以上的不同原理的检测方法得到阴性结果才能排除LA的存在；(2)依旧采用dRVVT和APTT实验，而在方法学上加以改变，采取改变磷脂的浓度或组成来确证LA的存在；(3)采用正常血浆进行纠正实验；(4)排除由其他原因所致的凝血时间延长。此外实验室还应该建立符合本实验室的LA参考范围，一般来讲，应选取40名以上的健康成年人作为样本，选取99%的健康人所在范围作为LA参考范围。而对于阳性对照，则采用混合患者血浆。

aCL和aβ2GPI抗体检测的标准化：2004年的欧洲抗磷脂抗体论坛提出了aPLs检测的最低要求：(1)每一样本均需复孔检测；(2)每个实验室都需设立本实验室参考范围，建议选取50名以上的健康人作为样本，依据人群的95.0%、97.5%和99.0%区间设立临界值；(3)使用外部质控品保证检测质量，如使用单克隆抗体HCAL(IgG)和EY2C9(IgM)作为aPLs检测的外部质控品[11]。而最新更新的aPLs检测指南[1]则更加全面地规范了抗体亚类选择、包被抗原、结果定量、标准单位、检测的校准验证、精密度和准确度等各个环节，主要有：(1)应同时检测IgG和IgM亚型；(2)推荐采用人源β2GPI作为抗β2GPI抗体检测的靶抗原，aCL的抗原应含有β2GPI成分；(3)采用GPL/MPL(1 mg/L纯化的lgG/IgM型aCL的结合抗原活性)作为aCL的国际标准单位，抗β2GPI抗体暂无国际标准单位；(4)采用外部质控品，外部质控品的生产需遵从美国食品和药物管理局(FDA)药品生产和质量管理指南或与之相当的质量保证方案，由于国内尚不能获取商业化的质控品，因此各实验室可以制备1.5～3倍临界值的混合阳性血清分装后，–80 ℃保存；(5)应采用多点定标的标准曲线；(6)可接受的批内和批间变异系数为20%；(7)实验室需要验证试剂盒所提供的参考范围。

2．aPLs检测标准化的重点：

(1)外部质控品的评价。单克隆抗体(HCAL和EY2C9)作为标准品并不能完全反映患者样本中aPLs的异质性，并且这些单克隆抗体通常用蛋白浓度作为单位，与国际通用单位之间的关系未得到交叉验证。此外，标准品的生产过程对其稳定性影响很大，因此确认标准品的制备、评估和稳定性。(2)国际通用单位体系的建立。目前aCL已有国际标准单位，但aβ2GPI抗体尚无国际标准单位。2013年第14届国际抗磷脂抗体会议重点致力于建立aβ2GPI的国际通用单位以及国际认可的单克隆或多克隆的标准品。多克隆的aβ2GPI标准品已通过亲和纯化APS患者的混合阳性血清获得，并以此建立aβ2GPI的通用单位(1个aβ2GPI单位相当于1 mg/L的亲和纯化的aβ2GPI活性)。新标准品被分发至各个抗磷脂抗体试剂生产商进行验证，若采用厂商各自的单位，IgG型aβ2GPI结果差异较大(115～9 993.1 U)，IgM型稍好(35.4～98.4 U)(各厂家试剂单位不统一，采用U指代单位)，当采用国际单位时大大减小了标准品结果的变异。美国INOVA公司也研发出相应的单克隆的标准品。目前，欧洲标准物质研究中心(The Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM)正在进一步验证这两类aβ2GPI标准品。(3)设立室间质量评价体系。目前美国的病理家学会(College of American Pathologists，CAP)和澳大利亚皇家病理家学会等机构设立了aPLs检测的室间质评。根据室间质评规则，CAP以80%以上的实验室的一致结果作为参考结果。然而，每年均有质评样本不能满足80%以上的一致率。目前国内尚未出现相应的室间质评项目。因此，迫切需要建立国内的aPLs室间质量评价体系以提高国内实验室aPLs检测的整体水平。(4)新的aPLs检测方法的引入：随着化学发光技术及免疫微球技术的引入，aPLs的检测不再局限于传统的ELISA法。这些新方法自动化程度高，重复性好，敏感度和特异度均较高，且可大大降低室间差异，有利于推进aPLs检测的标准化。我实验室最近评价了化学发光法和ELISA法对于检测IgG/IgM/IgAaCL和aβ2GPI抗体的相关性，发现二者存在显著的相关性，我们这一结果也说明了化学发光法可以作为ELISA的替代方法用于aCL和aβ2GPI抗体的检测。

四、抗磷脂抗体检测的展望

aPLs检测的重要性日益突显。然而，根据我们实验室所开展的卫生部公益性行业基金科研专项(201202004)的室间质量调查结果，部分实验室仅开展了aCL的检测或IgG型aPLs的检测，临床存在漏检的情况。因此，建议所有的实验室均应开展IgM型aPLs的检测，并且重视3个抗体均阳性的高风险预测价值。对于现存的aPLs检测结果变异较大的情况而言，国外的标准化组织提出了相应的操作指南，国内目前尚无此类指南发布，因此，迫切需要成立此类项目的标准化协作组以建立适应于中国人群的标准化指南。就实验室自身而言，实验室应严格遵循目前已有的国际指南，重视室内质量控制及室间质评。此外，为适应aPLs用于诊断APS的需求，必须开发新的特异性高的aPLs，研发敏感度和特异度均较高的检测方法。相信通过临床医师、专家委员会、实验室工作人员和试剂厂商等相关人员的共同努力，一定会促进aPLs检测的标准化的进一步发展，也真正才能发挥aPLs预测血栓形成和病态妊娠的重要价值。

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