锌转运蛋白8表位与1型糖尿病的研究进展

灌无节制

作者：吉林大学第二医院内分泌科  邹婧 刘煜

1型糖尿病(T1DM)是一种由T、B淋巴细胞共同参与的自身免疫性疾病，主要是因自身免疫系统对胰岛β细胞特异性破坏而导致体内胰岛素绝对缺乏，因而准确诊断T1DM及探讨其发病机制的有效手段是自身抗原成分的检测。大量的临床试验表明，T1DM的发病与体内多种自身抗体密切相关，包括胰岛细胞抗体(ICA)、蛋白酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2A)、胰岛素自身抗体(IAA)和谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)[1] - [4]。这些自身抗体联合检测是比较敏感的诊断指标，可提高胰岛自身抗体的阳性率[5]，尤其是对于那些高危人群，但其敏感性和特异性在普通人群筛查中却并不令人满意。为了T1DM的早期筛查与诊断，亟需探索新的分子靶点。人锌转运蛋白8(ZnT8)是新近发现的锌转运体家族中重要的成员之一，位于胰岛β细胞和少量的α细胞内，是胰岛特异性锌转运蛋白，在胰岛素的合成、储存及分泌过程中发挥着至关重要的作用。在T1DM中，随着对ZnT8作用的不断探索，以ZnT8为治疗靶点的研究正逐步成为热点。因此测定ZnT8的免疫反应性表位可用来提高对T1DM高危患者的危险分层预测，可作为临床预测疾病进程的早期标志，将为揭示T1DM的免疫学发病机制，且为预防和治疗T1DM提供新的研究策略。此外，针对ZnT8特异性表位的多肽疫苗或许会成为T1DM早期预防的新途径。本文对ZnT8抗原及其T、B淋巴细胞表位在1型糖尿病中的作用作一综述。

一、ZnT8

ZnT8又称SLC30A8，最先是用表达序列标签法(EST法)发现的，它定位于人类第8号染色体q24,11，是由SLC30A8基因编码。它的主要作用是参与胰岛素合成、储存及分泌的调节，主要定位于胰岛内的胰岛β细胞，能够介导锌离子从胞质转运至囊泡。研究发现，ZnT8在新发的T1DM患者中的阳性率高达60%～80%，且在IA-2A、IAA、GADA均阴性的T1DM患者中尚存在26%的阳性率[6]。日本的一项研究表明，ZnT8A在儿童新发糖尿病患者中的检出率明显高于成人[7]。而另一项研究发现，ZnT8A在暴发性T1DM、急性发病T1DM和隐匿性T1DM患者中的检出率分别为0%、58%和20%[8]。ZnT8A目前被国际公认是继ICA、IA-2A、GADA之后的第四种主要胰岛自身抗体。

二、抗原表位

抗原表位即抗原决定基，它通常由5～25个氨基酸残基组成，部分由5～7个多糖残基或核苷酸组成，是与抗体及B淋巴细胞受体/T淋巴细胞受体(BCR/TCR)特异性结合的基本结构单位。能够在免疫应答中被T、B淋巴细胞或特异性分子识别的抗原分子结合位点。在免疫应答中，TCR和BCR在所识别的表位上具有各自不同的特点，分别称为T细胞表位和B细胞表位。T细胞仅能识别线性表位，由抗原加工并提呈，而B细胞则既可识别线性表位，也可识别构象表位。

三、ZnT8的T淋巴细胞表位

T细胞分为CD4和CD8这两种不同的功能亚群。在糖尿病的发病中CD4+T细胞发挥着不可或缺的作用。对胰岛β细胞的损伤起重要作用的是CD4+T细胞中的细胞因子及Th1细胞亚群。而在最近的非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠试验中愈来愈多的证据表明，自身反应性CD8+T细胞(即细胞毒性T细胞，CTL)也具有十分重要的致病作用[9]。ZnT8蛋白可作为自身抗原引起以β细胞受损为特征的T淋巴细胞介导的自身免疫反应，甚至是诱发T1DM，其可能机制为：ZnT8抗原表位表达在β细胞表面，被主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类分子提呈，CD8+Tc细胞识别后经Fas/FasL途径和(或)穿孔素依赖性途径杀伤β细胞，β细胞经肿瘤坏死因子（TNF）-α和干扰素（IFN）-γ联合诱导后可能表达MHCⅡ类分子，从而将ZnT8抗原表位递呈给CD4+T细胞，后者能够分泌多种细胞因子，并且能激活巨噬细胞发挥其细胞毒性作用，最终损伤β细胞[10]。

Kawasaki等[11]研究T1DM患者中SLC30A8 Arg325Trp变异体与抗ZnT8自身抗体特异性之间的相关性，证实了氨基酸325上的变异残基影响着人类自身对ZnT8的反应性。人类ZnT8 C-末端区域至少包括两个不连续的表位，其中之一为依赖于第325位的精氨酸残基[12]。除此之外，也有一些研究发现，ZnT8与糖尿病的发生、发展有着密切的关系，其基因rs13266634(R325W)的单核苷酸多态性(SNP)与T1DM和T2DM存在显著相关性[13] - [15]。其可导致ZnT8第325位氨基酸的非同义突变(谷氨酸、精氨酸或色氨酸)。携带编码精氨酸的危险基因可使β细胞受损，导致胰岛素分泌减少。故在ZnT8A阳性的糖尿病患者中，SLC30A8 rs13266634基因型可作为预测T1DM危险程度分层的有效指标。

Scotto等[16]通过酶联免疫斑点技术(ELISpot)发现在HLA-A2+的白种人中，83%的成人T1DM患者和60%的儿童T1DM患者的自身反应性CD8+T细胞能够识别ZnT8抗原的一个区域片段(氨基酸186-194，VAANIVLTV)，而另一个序列(氨基酸153-161，VVTGVLVYL)也能够在20%的成人和25%的儿童T1DM患者中被识别。由此可见，ZnT8186 - 194和ZnT8153 - 161可能是免疫显性的CD8+T细胞表位，而且ZnT8反应性T细胞主要针对ZnT8186 - 194片段，能够在大部分T1DM患者中检测出来，其特殊免疫显性可能表明常见的环境因素能够诱发β细胞自身免疫。除此之外，该研究还发现与T1DM患者相比，T2DM个体对ZnT8的253-261区域氨基酸残基有更强的反应性。ZnT8253 - 261可以在25%的T2DM患者中被T细胞识别，这些患者的表型无明显区别，均抗体阴性且不需要应用胰岛素治疗。

研究者通过采集初发T1DM患者外周血，应用ELISpot研究发现ZnT8153 - 161、ZnT8245 - 254、ZnT8273 - 282和ZnT8314 - 322与HLA-A2*0201有较高亲和力，其稳定HLA-A2表达的水平>80%[17]。其中ZnT8153 - 161的离解率最低，由此可见，ZnT8153 - 161是人类T1DM中新发现的HLA-A2*0201限制性CD8+T淋巴细胞表位。除此之外，ZnT8245 - 254和ZnT8314 - 322同样具有高亲和力和低离解率。

有研究证实人类HLA-A*0201分子与T1DM的发生发展密切相关[18]。据统计，约60%的T1DM患者携带HLA-A*0201等位基因。因此，从自身抗原中筛选出其HLA-A*0201限制性CTL表位，对人类T1DM的预防及治疗具有重要意义。该研究通过免疫HLA-A2.1/kb Tg小鼠证明LLIDLTSFL(ZnT8107 - 115)、LLSLFSLWL(ZnT8115 - 123)和LLSILCIWV(ZnT8145 - 153)可在体外有效诱导抗原特异性CTL的产生，从而导致Tg小鼠发生糖尿病。国内也有文献报道，利用标准51Cr释放试验发现ZnT8107 - 115、ZnT8115 - 123和ZnT8145 - 153与HLA-A*0201分子具有较高的结合荧光强度，能够刺激T1DM患者外周血单个核细胞分泌IL-2和IFN-γ，并对抗原肽负载的Th2细胞具有明显的杀伤效应[19]。最近有学者通过制备含有ZnT8表位肽(ZnT8107 - 115)和B、T淋巴细胞弱化因子(BTLA)的疫苗，免疫人外周血单个核细胞，观察其对CD8+T细胞的抑制效应。实验结果提示该疫苗能有效抑制人外周血单个核细胞的CD8+T细胞增殖、细胞因子分泌和对靶细胞的杀伤能力[20]。这些研究均提示ZnT8107 - 115、ZnT8115 - 123和ZnT8145 - 153可能是ZnT8的HLA-A*0201限制性CTL表位，此发现为将来深入研究表位特异性CD8+T细胞应答在T1DM中发挥的作用提供了理论依据。

Dang等[21]研究发现HLA-DR3(0301)和-DR4(0401)等位基因与T1DM的发病密切相关。特别是HLA-DR4(0401)，在患者组的35例T1DM患者中，有19例患者有该基因的表达。同时发现ZnT88 - 22、ZnT815 - 29、ZnT8120 - 134、ZnT8134 - 148、ZnT8260 - 274、ZnT8267 - 281和ZnT8295 - 309可能包含T1DM相关表位。此外，研究还证明ZnT8155 - 169和ZnT8323 - 337可能是HLA-DR3限制性T淋巴细胞表位。

目前ZnT8相关T淋巴细胞表位日益受到国内外专家、学者的广泛关注，大量的动物及临床试验发现了不同的抗原表位，通过筛选关键的T1DM自身抗原T淋巴细胞作用表位并明确其在免疫反应中的作用，为进一步早期预测和防治T1DM提供新的靶点。通过从科研应用到临床应用的转化，能够为更多的T1DM患者及亲属提供诊断及治疗依据，为疾病的早期筛查与早期防治提供新的手段。

四、ZnT8的B淋巴细胞表位

在T1DM中胰岛β细胞的浸润除了CD4+和CD8+T细胞以外，还有B细胞以及其他的抗原提呈细胞参与。Henry等[22]研究证实清除B细胞可使NOD小鼠不发生糖尿病。在人体，临床研究对新诊断的T1DM患者给予利妥昔单抗清除B细胞，可明显保存β细胞的功能[23]。此外，B细胞可选择和激活自身反应性T细胞，通过产生自身抗体和抗原提呈作用而影响T1DM的发展。由此可见，B细胞及其表位的研究对认识T1DM的致病机制有着重要的意义。但是目前B细胞特别是自身反应性B细胞及其天然自身抗体在T1DM中的作用机制尚不清楚。

ZnT8能通过激活B细胞而参与诱导β细胞死亡。研究发现，在胰岛受损区域存在相当大比例的B细胞。NOD小鼠实验表明，静脉输入的B细胞可经B细胞化学诱导物（BLC）作用后在胰岛中形成异位滤泡区[24]。B细胞能够产生特异性ZnT8A，该抗体可在T1DM前驱期持续存在，并且抗体浓度随着年龄的增大而升高，最终导致β细胞的损伤。

有研究发现：在112例新发病的T1DM患者中，50%以上的患者对ZnT8A表位羧基末端的101个氨基酸（氨基酸268‑369）有抗体反应性[25]。8%的患者对氨基末端的74个氨基酸（氨基酸1‑74）有抗体反应性。此外，研究还发现编码小鼠羧基末端的探针不能被大多数ZnT8A+患者的血清所识别，为探究其原因，研究者通过构建基于Yiip大肠杆菌X射线晶体结构的ZnT8羧基末端分子模型，证明人类R325R332E333K336K340与小鼠该位点氨基酸不同，提示R325R332E333K336K340可能是人类ZnT8羧基末端的主要的非限制性B细胞表位。

在过去的十年里，关于B细胞在T1DM中作用的研究越来越多，但对ZnT8的B细胞表位预测的研究还甚少，还有待进一步的研究。

综上所述，自身抗原表位的研究对于T1DM的预防及治疗起积极的作用。该领域中对胰岛素、GAD65和IA‑2的研究相对较多一些，包括大量的动物实验和少量临床研究，而关于ZnT8在T1DM预防方面的研究还较少，相信随着研究的深入，ZnT8的生理功能及其在T1DM基础和临床研究中的意义将会不断得到阐明。

参考文献略