光激化学发光技术原理及应用介绍

财小弟

近半个世纪以来，临床化学微量免疫分析技术从上世纪60年代的放射免疫分析，70年代初的酶联免疫分析，到70年代末化学发光免疫分析，经历了标记物由放射性同位素（3H、14C、125I等）、酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶）到化学发光物质（吖啶酯、鲁米诺等）的革新和检测技术由手工操作到全自动检测的飞跃，带来了医学检验质量和数量的迅速提高；90年代问世的LOCI（Luminescent oxygen channeling immunoassay, LOCI）技术以其独特的能量传递机制和化学发光原理，实现了均相、一步法、免清洗和高通量检测，并以其高灵敏度和特异性等突出检测性能，和包括DNA检测、新药开发在内的广泛用途而为世人所瞩目。该技术最初由Ullman等人在1994年报道，后由PerkinElmer公司生产相关试剂（AlphaScreenTM）。我国科研工作者在学习国外技术的基础上，勇于探索，对该技术从试剂到设备进行了进一步改良，开发了拥有自主知识产权的光激化学发光系统（Light initiated chemiluminescence assay, LiCA）。本文就该技术基本原理和特点进行简要介绍：

一、原理
       

        光激化学发光是以纳米级高分子微粒为基础的新一代化学发光技术，该项技术被广泛地应用于研究生物分子的相互作用。正如名称所示，LiCA的主要原理是由光激发产生的均相化学发光技术。它具有快速、均相（免冲洗）、高灵敏和操作简单的特点。
       

        LiCA试剂由含有感光化合物的感光微粒和含有发光化合物的发光微粒组成，微粒直径约188nm，表面覆盖多糖水凝胶。水凝胶能减少非特异性结合，同时，增加微粒的悬浮性。微粒通过水凝胶表面的功能团与生物分子共价连接。纳米级微粒大大增加了反应的表面积，每个微粒的表面站立着成百上千个生物分子，随时准备着捕获目标分子。

        LiCA技术的核心原理是高能态离子氧的产生和传递。在受到红色激光（680nm）照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为高能态离子氧，离子氧的生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了离子氧的传播直径很小（约为200nm）。如果发光微粒在200nm范围之内就能接受离子氧，并发出高能级的光（610nm）。相反，如果在200nm直径范围内没有发光微粒，高能态离子氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是LiCA均相反应的基础。通常在LiCA反应体系中，微粒的浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了两个微粒的距离，例如形成免疫夹心或受体-配体复合物，这样就能产生能量的有效传递并发出光信号。
        原理图


二、技术特点

        1. 高灵敏度
        光信号的产生是逐级放大的化学反应的结果。感光微粒富含感光化合物，在680nm激光照射后，每个微粒会每秒释放出60000个离子氧，离子氧作用于发光微粒中的二甲基噻吩衍生物产生大量的紫外光，由此完成第二级放大。紫外光激发镧系元素，最后由包埋在发光微粒中的镧系元素释放光能从而完成第三级放大过程。这样三级梯度递增的放大过程将LiCA的实际检测能力提高至10-15摩尔（femtomole）水平。

        2. 低本底
        形成低本底的三个原因如下：
       

        第一，由于绝大部分的天然荧光的寿命小于100纳秒，而发光微粒的稳定发光时间超过1秒，因此我们采取时间分辨模式采集光信号，也就是在激光器关闭后50-100毫秒采集光信号。这种模式能有效排除来自样本的非特异性背景荧光的干扰。
       

        第二，由于LiCA采用680nm红光激发，而红光的能级几乎不可能激发生物样品或微孔板中的荧光物质，因此本底很低。
       

        第三，LiCA发射光的波长比激发光的波长短，能量更高，所以称为化学发光。与荧光产生原理相反，荧光原理是激发光为高能量的而发射光为低能量的。由于生物体内富有天然的荧光物质，用荧光法测定生物样品本底会较高，而LiCA检测反其道而行之，采用低进高出，有效降低本底。

        3. 目标分子的多样性
        使用LiCA能实现对多种生物分子的测定。酶的活性、受体-配体反应、低亲和力的反应、第二信使水平、DNA、RNA、蛋白质、多肽、碳水化合物、小分子、大分子都能用LiCA进行测定。如果您能结合、标记或切割，就能用LiCA进行检测。

        4. 检测低亲和力分子
        LiCA技术的另一重要特点是能够检测任意结合强度的生物分子。LiCA技术适用于低亲和力生物分子的检测。抗原-抗体或其他生物分子的结合反应通常是一种动态的反应。传统的技术是对单个抗体（受体）进行标记，因此反应进行时总有相当部分的抗体（受体）处于非结合状态从而减弱信号量。而LiCA技术是基于感光-发光微粒通过其表面的几十、几百甚至几千个生物分子相互接触、对接而发生信号。信号的产生不仅仅依靠生物分子一对一的结合关系。尽管低亲和力大部分处于非结合状态，但只要有几个或几十个抗体（受体）处于结合状态就能维持感光-发光微粒的复合体，从而发出信号光。因此，LiCA技术成功地解决了检测低亲和力分子的问题。

        5. 易使用
        LiCA技术适用于临床免疫的各项检测，也可应用于生命科学的基础研究和新药的筛选。博阳生物经过精心的研究，已将标记过程和反应条件进行优化和精简。客户可以根据自己的需求，进行标记，也可以由博阳生物替客户完成。由于LiCA技术是均相化学发光，因此，检测的过程十分方便。客户只需要将样品和两种试剂混合即可。LiCA分析仪会完成其余的操作步骤。因为避开冲洗且简化了反应步骤，使得反应重现性变好，减少反应时间。

        6. 高通量
        LiCA技术采用纳米级微粒作为生物分子的载体，反应表面积比微孔板或微米级载体提高数十倍。因此，反应所需时间缩短，温育时间控制在十几分钟至半小时内。高通量LiCA分析仪（LiCA HT）以每孔一秒的速度检测，通常只需要5分钟就能完成288个检测。LiCA移液工作站（LiCA SP）可以将试管中的样品和所需试剂分配至微孔板，通常只需20分钟就能完成288孔的加液工作。

        7. 稳定性
        LiCA试剂中的能量产生、传递和放大过程是由微粒中的有机分子和溶液中的离子氧来完成的。感光有机分子受到微粒的保护，它的环境十分稳定和安全。溶液中的氧浓度又是一个常数。因此，整个能量（光）的产生、传递和放大过程十分稳定，不易受到pH值、离子强度和温度的影响。因此，无酶参与的LiCA系统比传统的以酶为催化核心的发光技术更稳定。

        三、应用类型
        LiCA技术提供了检测多种生物学交互作用的可能性，包括酶、受体-配体交互作用、低亲和力交互作用、第二信使水平、DNA、RNA、蛋白质、肽类、糖类和小分子。因此，LiCA技术能够广泛应用于临床免疫的各项检测、生命科学的基础研究及新药筛选等领域。此外，功能强大的LiCA技术能轻松适用于多种测试模式，包括竞争、联合、分裂、探测、直接与间接测试。

        1. 配体-受体
        肿瘤坏死因子受体（sTNFR1）可以识别肿瘤坏死因子配体（TNFa）并与其特异性地结合，所以如果要检测标本中是否含有sTNFR1，我们可以将生物素（Biotin）标记的TNFa、标本和抗-TNFR1包被的发光微粒（FG）混合，温育后加入链霉亲和素感光微粒（GG-SA）。若标本中含有sTNFR1，则会形成GG-SA-Biotin-TNFa-sTNFR1-抗-TNFR1-FG夹心复合物，且最终发光量的多少与标本中sTNFR1的浓度成正比。

        2. 激酶
        蛋白激酶B（Akt）可以将糖原合酶激酶-ß（GSK3）磷酸化而使其失活，所以如果要检测标本中是否含有Akt，我们可以将生物素（Biotin）标记的GSK3、标本和抗-GSK3抗体包被的发光微粒（FG）混合，温育后加入链霉亲和素感光微粒（GG-SA），形成GG-SA-Biotin-GSK3-抗-GSK3-FG夹心复合物并发光。若标本中含有Akt，则可以使GSK3失活，从而断开GSK3与抗-GSK3之间的链接，减少发光微粒的发光量。而最终发光量的多少与标本中Akt的浓度成反比。

        3. 蛋白质-蛋白质
        HDM2癌蛋白与p53结合后会抑制p53抑癌基因的活性，增大乳腺癌发生的几率。所以如果要检测标本中是否含有HDM2癌蛋白，我们可以将生物素（Biotin）标记的p53、标本（事先与GST融合）和抗-GST包被的发光微粒（FG）混合，温育后加入链霉亲和素感光微粒（GG-SA）。若标本中含有HDM2癌蛋白，则会形成GG-SA-Biotin-p53-HDM2-GST-抗-GST-FG夹心复合物，且最终发光量的多少与标本中HDM2的浓度成正比。

        4. 免疫
        由于抗原-抗体能够特异性地结合，因此我们可以用LiCA技术检测标本中是否含有待测抗原或抗体。举例：如果要检测标本中是否含有乙肝表面抗原（HBsAg），我们可以将生物素（Biotin）标记的抗-HBs、标本和抗-HBs（针对不同抗原表位）包被的发光微粒（FG）混合，温育后加入链霉亲和素感光微粒（GG-SA）。若标本中含有HBsAg，则会形成GG-SA-Biotin-抗-HBs-HBsAg-抗-HBs-FG夹心复合物，且最终发光量的多少与标本中HBsAg的浓度成正比。

        5. 蛋白酶
        血管紧张素I 转换酶ACE可以切割血管紧张素I使其转变为血管紧张素II，所以如果要检测标本中是否含有ACE，我们可以将生物素（Biotin）标记的血管紧张素I 、标本和抗-血管紧张素II包被的发光微粒（FG）混合，温育后加入链霉亲和素感光微粒（GG-SA）。若标本中含有ACE，则血管紧张素I 会转变为血管紧张素II，从而形成GG-SA-Biotin-血管紧张素II-抗-血管紧张素II-FG夹心复合物，且最终发光量的多少与标本中ACE的浓度成正比。

        6. 蛋白质-DNA
        雌激素受体a（ERa）与雌激素受体反应元件（ERE）能够相互结合从而进行转录作用，所以如果要检测标本中是否含有ERE，我们可以将生物素（Biotin）标记的ERa、标本（事先用地高辛标记）和抗-地高辛包被的发光微粒（FG）混合，温育后加入链霉亲和素感光微粒（GG-SA）。若标本中含有ERE，则形成GG-SA-Biotin-ERa-ERE-地高辛-抗-地高辛-FG夹心复合物，且最终发光量的多少与标本中ERE的浓度成正比。（资料来源：博阳生物）
       

        总而言之，光激化学发光分析（LiCA）以其独特的检测技术实现了均相、免清洗检测；与传统免疫分析方法比较，具有类似或更优越的检测性能，是临床和科研工作者进行超微量检测分析的又一重要工具，是一种值得在临床推广的新检测技术。