人类免疫缺陷病毒检测的问题与思考

岳光

人类免疫缺陷病毒检测的问题与思考

       李金明，研究员，医学博士。卫生部临床检验中心副主任。中国医学科学院北京协和医学院和北京大学医学部博士生导师，享受国务院政府特殊津贴，获2009-2010年度卫生部有突出贡献中青年专家称号。自上世纪90年代以来，在国内系统提出了临床分子诊断质量管理和标准化的概念和方法。研究方向为：临床分子诊断方法及标准化。以项目负责人承担国家自然课题5项，863课题1项，传染病重大专项课题1项。以第一和通讯作者发表论文160多篇（其中SCI论文50篇）。经第一完成人获北京市科技奖二等奖1项，三等奖2项。

       人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）在国内俗称艾滋病病毒，是获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS，国内俗称艾滋病）的病原体，于上世纪80年代初由美国和法国学者分别分离得到，曾被称为命名为淋巴腺病相关病毒（Lymphadenopathy Associated Virus，LAV）、嗜人T淋巴细胞Ⅲ型病毒（Human T-cell Lymphotropic Virus Type Ⅲ，HTLV-Ⅲ）和AIDS相关病毒（AIDS Related Virus，ARV），1986年由国际微生物学会及病毒分类学会进行了统一命名。HIV是引起细胞病变的灵长类逆转录病毒之一，属逆转录病科（Retroviridae）慢病毒亚科。HIV与乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）和丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）一样，主要是经血传播，传播的主要形式有不洁性行为（如男男同性和非安全的异性）、共用针管吸毒等，日常的生活接触并不会造成感染传播。

       HIV感染的筛查检测主要通过特异抗体进行，抗-HIV检测共经历了四代试剂的发展历程，第一代试剂为使用于体外培养的病毒裂解物作为抗原，而建立的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测定方法，测定的特异抗体为IgG类。第二代试剂则采用基因工程重组抗原或合成肽替代培养病毒抗原，测定模式仍为间接法。第三代试剂使用的抗原与第二代相同，但其采用双抗原夹心法替代间接法，所测定的抗体不但有IgG类，还有IgM和IgA等，测定敏感性大大提高。第四代抗-HIV检测ELISA试剂盒则为抗体和P24抗原联合检测试剂，为缩短HIV感染检测的窗口期。

       与特异抗体和抗原检测相比，HIV核酸检测除了可用于HIV感染检测，并有效缩短检测窗口期外，其定量检测则主要是用于抗病毒药物治疗的疗效监测。

一、关于HIV抗体检测试剂的检测性能评价

       病原体特异抗体或抗原的ELISA等免疫检测试剂，在正式用于筛查检测之前，应进行检测性能评价或验证。对于定性测定，一般意义上的性能指标通常包括重复性、准确性、分析特异性、分析敏感性（测定下限）、抗干扰能力（溶血、脂血、黄胆、类风湿因子等）。目前在临床实验室，对抗-HIV ELISA等免疫检测试剂的性能验证通常存在以下误区：（1）采用稀释标本对试剂方法的分析灵敏度进行评价；（2）使用室间质量评价（或称能力验证）样本评价准确度。

       对于病原体的特异抗原， 如HIV 的p24 抗原、乙肝表面抗原（HBsAg）等，可采用系列稀释的已知浓度标准品或临床标本评价特定试剂方法的分析灵敏度（测定下限）。但这种方法用在特异抗体的检测试剂性能评价，则是错误的。因为通常一个患者标本内的抗原为单一成分，样本稀释前后的抗原是相同的，而感染者体内的特异抗体，则是多种抗体（特异IgG、IgM、IgA等）和针对病原体多种不同抗原表位的抗体所组成的一个混合体，并且机体在对病原体抗原的免疫应答中，由于各种抗原的免疫原性的差异，针对有些表位的抗体倾向在感染早期出现，且多为IgM和IgA类，在血液中持续存在时间较短，而针对另一些表位的抗体，虽可能较后出现（多为IgG类），但可长期高浓度存在于血液中。因此，如果使用一份抗体强阳性的标本进行系列倍比稀释，其最后留下的低浓度抗体并非是机体感染病毒后最早出现于血液中的抗体，反而是很晚出现在
血液中的抗体，对病毒感染较晚出现抗体的分析灵敏度高，与特定试剂方法对HIV等病毒感染的早期检出能力无关，这样的评价就没有意义。因此，评价病原体特异抗体检测试剂对早期感染检测能力，应采用转化血清盘，即机体在感染病原体后，较短间隔时间（数天）持续采集的多份未经稀释的样本组成的样本盘，哪个试剂能最早检测到抗体，则说明该试剂盒对早期感染的检测能力（或检测灵敏度）强。

       对于抗-HIV试剂方法的准确性评价，不能采用室间质评样本，其原因是质评样本通常不是来自感染者的未经稀释处理的原始样本，且数量过少，不能达到评价试剂盒准确性的目的。准确性评价有两种基本方法，一是方法学比较，也就是将待验证试剂方法，与实验室在用的经过验证的试剂方法或公认的试剂方法进行对临床日常标本的平行检测比较，要求阳性标本不少于50份。然后观察两种试剂方法的阴性和阳性的符合情况，不符的标本再用第三种或“金标准”方法（如确认试验）进行确认。最后，统计分析待验证试剂方法的
阳性和阴性符合率，完成方法学比较。二是与已有明确结果的血清盘比较。血清盘通常由一定数量（建议不少于50份）的明确的阴性和阳性样本组成，阴性和阳性样本各一半，均为来自感染者的天然样本。阳性样本为自然人群感染后筛查得到，并经确认实验确认。在组成样本盘时，不同程度阳性（强、中和弱）及不同蛋白印迹（WB）模式的样本可根据在自然人群中筛到的分布情况来决定。血清盘样本结果待验证试剂方法的“金标准”，检测后，可计算得到待评价试剂方法的特异性和敏感性。

二、关于抗-HIV抗体检测筛查的确认

       由于抗-HIV免疫测定常会因为临床标本中的一些内源性干扰物质如类风湿因子、血红蛋白、补体、异嗜性抗体等的存在，而出现假阳性结果。此外，处于“灰区”的弱阳性反应结果，以及操作中的人为因素、试剂或标本的细菌污染等也会造假阳性结果。通常一个抗-HIV抗体检测试剂盒的阳性预示值（亦即测为阳性的样本为真阳性的可能性）除了与试剂盒的特异性和敏感性有关外，也与这种HIV感染在所测人群中的流行率有关，如果流行率很低，则既使是一个具有99%敏感性和99％特异性的试剂盒，其测定得到的阳性结果中可能绝大部份为假阳性结果。反之，如果人群流行率达到30%，则测定得到的阳性结果近95%为真阳性（表1)。

人类免疫缺陷病毒检测的问题与思考

       假定一个抗-HIV ELISA试剂盒的敏感性和特异性均为99.9%，如果HIV人群感染率为1.0%，则阳性预示值为91%，假阳性率小于10%，如果流行率为0.04%，则阳性预示值为28.4%，假阳性率大于71%。HIV在我国的普通人群中流行率极低，有研究表明，我国献血人群中用第三代试剂筛查阳性率为0.2%（2439/1,195,286），经确认阳性0.0009%（11/1,195,286）。因此，如按0.0009%的献血人群HIV感染流行率来计算，则假阳性率大于99%。因此，在我国对抗-HIV筛查得到阳性反应结果，必须由HIV确认实验室采用WB进行确认，只有确认阳性的结果才能报告。但目前由HIV确认实验室进行的确认存在以下问题，即（1）WB确认结果中的不确定结果的问题。在国家疾病预防控制中心（CDC）发布的2009版“全国艾滋病检测技术规范”中规定，WB确认实验结果为“不确定”的，应对被检者进行随防直至8周。这种长时间的随防对被检者而言，毫无疑问有着巨大的心理压力。（2)第四代试剂应用带的WB确认的不充分性。第四代试剂为抗原和抗体联合检测试剂，目前在采供血机构和医疗机构实验室正广泛使用，其检测出现阳性反应结果后，显然只是采用只能确认抗体的WB方法进行确认，确认阳性没有问题，但如果WB确认阴性，则不能排除只是抗原阳性的“抗体窗口期”。问题是绝大部分筛查阳性反应的标本WB确认为阴性，那么这种确认的价值就很小了。而且国内的HIV确认实验室基本上只有WB确认能力，不具备病毒核酸检测和病毒培养能力。

       我们知道机体感染HIV后，最早在血循环中能检测到的是病毒核酸，然后是P24抗原，再就是特异的IgM、IgA抗体，然后是特异IgG抗体，IgＧ抗体出现后，可以长时间高浓度存在。与丙型肝炎病毒不一样的是，当特异抗体出现后，病毒核酸是伴随存在的，这可能是因为HIV感染的细胞是外周血的CD4淋巴细胞，病毒很容易释至血液所致（图1)。因此，一个解决上述HIV确认实验中存在的两大问题的最有效解决方案是，筛查呈阳性反应的标本首先直接进行病毒核酸检测，核酸检测阳性者，直接报告确认阳性、阴性者，再进行WB（排除个别已有免疫缺陷者因为CD4淋巴细胞数量极少而致核酸检不到的情况）。这种方案就要求目前国内的HIV确认实验室应尽快建立病毒核酸检测的硬件（有符合分区要求的PCR实验、仪器设备和人员）和软件（标准操作程序即SOP），因为病毒核酸检测对人员及操作的要求较之抗原和抗体检测更高，否则会因为实验室扩增产物残留以及标本间交叉“污染”带来假阳性结果，造成将假阳性结果报告为阳性的问题，进而对被检者造成严重后果。

人类免疫缺陷病毒检测的问题与思考

                                                                                摘自定向点金《临床实验室》杂志2014年第六期
                                                                                                          编辑：范伟伟