MALDI-TOF程序

钮留

Christopher Doern博士是西南德克萨斯州立大学儿科病理学助理教授，达拉斯儿童医学中心临床微生物学主任，该儿童医学中心是美国第一家应用MALDI-TOF串联质谱法鉴定微生物的儿科实验室。2013年7月29日Christopher Doern博士于2013年AACC年会上发表题为《Applications of MALDI-TOF for the Diagnosis of Infectious Diseases》的报告，介绍了使用这项新技术的经验及其如何改变我们诊断传染病的方式，现将Doern博士的演讲整理如下，以期指导该技术在临床实验室中的应用。
        质谱分析法在微生物学中是一种创新，该基础入门课程介绍了这项技术的不同组成部分，工作原理，确认程序，未来可能应用的方向，以及使用这项技术对病人护理的影响。
        为了了解MALDI-TOF的影响，必须了解诊断传染病的程序以及我们面对的连续统一体（continuum）。从传统上来讲，微生物学实验室是最慢的实验科室，可能需要数天来完成检测。我们从标本收集、运输和处理开始，在医院中需要数小时。然后是培养阶段，也是使我们落后的阶段，在没有获得微生物之前我们什么也做不了。标准的细菌微生物培养需要24-48个小时，真菌或分支杆菌培养时间更长。最后是分析阶段，时间为一天或更长，分析方法通常依据培养而定。因此，在发布确定性鉴定和易感性结果之前需要数天（图1）。那我们在哪里做治疗决定呢？因为改变病人管理的方式是我们的目标，所以答案是在整个过程中。医生在决定病人患病的期间调整治疗方法，因此我们尽可能发布更多信息。问题在于让微生物学家受挫折的是，在他们获得最可靠最确定的信息之前医生已经做了3或4个治疗决定。最后，在大多数情况下我们对病人治疗方法的作用很小。

       

        微生物学为什么这么慢？一个很好的例子是在分析之前需要培养。我们经常面对混合培养，不只有一个分析物，有些标本包含很多不同的微生物。如果我们对其中一种微生物感兴趣我们必须再次培养（subculture），经过纯粹培养后才能进行鉴定。我们使用基于培养的系统，这也需要时间。5-10年后，我们可能直接根据标本类型检测鉴定，但是现在我们还没有到那个程度，所以我们仍需收集标本，培养标本然后分析。
        传统做法是先培养，观察到微生物后再次培养。微生物生长时间需要16-18个小时，然后进行鉴定和敏感试验，鉴定最少需要6-8个小时，直到获得鉴定结果需要3天。MALDI-TOF可从单菌落或单分离菌落鉴定。我们之前做次代培养，现在直接把微生物放到钢板上，放入仪器分析。这是蛋白分析，不是基于培养的分析。生物化学反应通常需要6-24个小时，现在我们只需30秒。周转时间得到显著提高。

       

       

        细菌鉴定MALDI-TOF技术有2个选择：一个是Bruker Microflex（布鲁克），另一个是bioMerieux Vitek MS（生物梅里埃），都仅供研究使用（RUO），都在申请FDA批准。我们实验室使用的是BrukerMicroflex，但是两个仪器或两项技术的工作流程是相似的。因此，使用Bruker Microflex的很多经验也适用于bioMerieux Vitek MS。

       

       

        MALDI-TOF程序

标准工作流程是把标本和基质放到靶板上，待其干燥，放入容器。在分析阶段，激光电离使蛋白质产生光谱。光谱图分析本质上就是微生物的指纹谱。把蛋白质分析与数据库比较，数据库包括代表各种微生物的4,000或5,000个不同光谱。模式匹配得出分数，分值大于2.0鉴定到种，所以绿脓杆菌是确信的物种。分值在1.7-2.0之间鉴定到属，即可以鉴定到假单胞菌属而不能鉴定出是绿脓杆菌。为了微生物学家简便起见，还做了颜色编码。绿色代表可以继续（确信物种），黄色代表警告（确信属），红色代表停止（鉴定不可信），见图4。        

       

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