免疫肝病专家答疑（二）

老三

7、淮安市第四人民医院检验科     联系人：夏春祥
致病的分子机制方面研究进展！实验诊断方面，特别是HBV HCV等。谢谢！！
       仲人前教授：乙型、丙型肝炎病毒致病分子机制方面的研究一直是病毒学研究的热点。肝炎病毒特异性受体，HBV DNA整合机制及后果，肝炎病毒蛋白与肝细胞蛋白间的相互作用，HBV/HCV的RNA/DNA结合蛋白，肝炎病毒蛋白的反式激活作用等尚未完全阐明。乙型肝炎病毒基因组由不完全的双链DNA组成。HBV-DNA以游离的或染色体外DNA；或整合的或染色体内DNA的方式存在于宿主的肝细胞内。乙型肝炎病毒表面抗原蛋白包括前S1、前S2和S蛋白，是HBV结合肝细胞膜上特异性受体的主要蛋白成分，但HBV特异性肝细胞受体目前尚未确定。研究表明，前S1蛋白在HBV结合与感染肝细胞过程中具有重要作用。病毒进入肝细胞后，在肝细胞内有两种调控方式：一是顺式调节，如启动子及增强子序列，以直接方式影响另一些基因
组功能，是基因组内部调节方式；二是反式调节，即基因组中一部分基因片段通过其转录或翻译产物产生对另一部分基因片段表达的调节方式，如病毒基因组表达的反式激活蛋白，以其表达产物的间接方式参与另一些基因的功能调节，可以对基因组内部基因片段，也可以对另外细胞或病毒的基因组有调控作用。乙肝病毒检测项目包括前S1抗原，表面抗原、表面抗体、e抗原、e抗体，核心抗体，核心抗体IgM，HBV DNA拷贝数、HBV基因变异及YMDD耐药检测等。
       HCV感染细胞的分子机制尚不清楚。目前发现HCV感染靶细胞涉及CD81，LDLr (低密度脂蛋白受体)和SR-BI（清道夫受体B类I型分子）三个受体分子。已分离到HCV6种基因型和多种亚型，可能在HCV急性感染慢性化中起重要作用。HCV的实验室诊断项目包括HCV抗体，HCV RNA及HCV基因型的检测。
8．解放军第九四医院检验科     联系人：王占科
乙肝两对半定量检测问题。
       张正教授：乙肝两对半的EIA及发光检测均是利用抗原-抗体反应原理，被测物质为未知量与试剂不可能完全匹配，因此一般检测为定性。如要定量一定要与标准品严格比对检测后计算方可。
9、解放军第三七一中心医院检验病理科     联系人：戴启宇
①乙肝病毒变异问题？
②乙肝病毒变异导致的检测困难问题？
③乙型肝炎治疗问题？
       仲人前教授：①有研究表明在抗HBe抗体和HBV-DNA均阳性的患者存在HBV基因组突变现象，主要在C基因的前C末端出现3个点突变，分别在第1896，1899位鸟苷酸被腺苷酸替代，第1909位胞嘧啶被胸腺嘧啶所替代。现已发现S基因区也可出现变异。HBV-DNA阳性而HBsAg阴性感染者在S基因区第823位鸟苷酸被腺苷酸取代，使苏氨酸变为精氨酸，改变了HBsAg抗原性而难检出。
       ②现有研究表明C及S基因区均有可能出现变异。当临床怀疑有乙肝病毒感染，HBsAg或HBeAg阴性时应考虑有无变异的可能。可以进一步进行HBV DNA定性定量检测或乙肝病毒基因变异（耐药）生物芯片检测。
       ③慢性乙肝治疗的总体目标是最大限度长期抑制或消除HBV，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延缓和阻止疾病进展，减少和防止肝脏失代偿、肝硬化、肝癌及并发症的发生，从而改善生活质量和延长存活时间。其治疗主要包括：抗病毒，免疫调节，抗炎保肝，抗纤维化，对症治疗。国内外公认有效的抗病毒药物有干扰素类药物，如普通干扰素α，聚乙二醇干扰素α；核苷类似物，如拉米夫定，阿德福韦酯，恩替卡韦等。
10．绵阳市第三人民医院检验科免疫室     联系人: 刘国雄
希望介绍免疫方面的质量控制，以及一些免疫最新技术和项目。能请临床专家解读一些免疫专题，如甲状腺类，性激素类等。
       张正教授：有关免疫指控，从流程讲应分别注意分析前、中、后的全称质控。分析前主要是取血注意事项、拒收标准、保存及运输、条件及时间控制；分析中主要是室内控制和参加空间质控计划（或比对计划）；分析后为报告的正确书写及传输和检验质量反馈。总之，质控应是系统工程，不是一时一事的控制。
       仲人前教授：这是涉及面很广的问题，由于篇幅有限，仅概要介绍。免疫质量控制包括分析前，分析中，分析后质量控制。分析前质控包括试剂盒的选择、使用和保存；并从灵敏度、特异度、精密度、稳定性、安全性、经济性等各方面进行评价。仪器如移液器、酶标仪、洗板机等需要进行定期校准和测试。患者标本也可能存在干扰因素，如类风湿因子、异嗜性抗体、溶血、脂血、某些自身抗体等。离心转速及时间也会影响标本的质量。分析中的质量控制包括室内质控物的选择和正确使用，失控原因分析、仪器定标，室间质量评价等，分析后质控包括正确发出和解释报告结果。
       目前临床应用较多的是酶联免疫吸附试验、凝集试验、速率散射比浊法、化学发光免疫分析法、微粒子酶免疫分析法、流式细胞术、实时荧光定量PCR技术、DNA探针杂交等。最新的技术包括液相芯片检测、测序技术、核酸等温扩增技术等均有很好的临床应用前景。新项目很多，比如幽门螺旋杆菌抗体检测、呼吸道病原体抗体九联检、白细胞介素、食物不耐受检测等。
11．浙江绿城医院检验科     联系人：钟步云
酶标法乙肝三系测定结果各单项阳性的解读（临床意义）问题？
       张正教授：1、HBsAg：乙肝病毒感染的确证。
       2、抗HBs：乙肝患者的保护性抗体。患者痊愈的标志。疫苗注射后免疫成功的标志。
       3、HBeAg：乙肝传染性的标志。
       4、抗HBe：乙肝患者有一定的对HBV有免疫力的标志，一般患者出现HBeAg向抗HBe血清转换后，临床病情相对稳定，传染性下降。
       5、抗HBc：乙肝感染标志，非保护性抗体。
       仲人前教授：1、乙肝表面抗原（HBsAg）：是乙肝病毒的外壳蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志。它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、泪水、鼻咽分泌物、精液及阴道分泌物中。在感染乙肝病毒后2～6个月，当丙氨酸氨基转移酶升高前2～8周时，可在血清中测到阳性结果。急性乙肝患者大部分可在病程早期转阴，慢性乙肝患者该指标可持续阳性。
       2、乙肝表面抗体（抗-HBs）：当乙肝病毒侵入人体后，刺激人的免疫系统产生免疫反应，B淋巴细胞分泌出一种特异的IgG，就是表面抗体，它可以和表面抗原特异地结合，然后在体内与人体的其他免疫功能共同作用，把病毒清除掉，保护人体不再受乙肝病毒的感染，属于一种保护性抗体。人自然感染后或注射乙肝疫苗后，均可产生乙肝表面抗体。
       3、乙肝e抗原（HBeAg）：来源于乙肝病毒的核心，是核心抗原的亚成分，或是核心抗原裂解后的产物。当核心抗原裂解时，可溶性蛋白部分（即e抗原）就溶于血清，存在于血液循环中。e抗原阳性表示病毒复制活跃，并且传染性较强。
       4、e抗体是乙肝e抗体的简称（抗-HBe）：它是由e抗原刺激人体免疫系统产生出来的特异性抗体，这种特异的e抗体能够和e抗原结合。当乙肝患者由HBsAg(＋)转变成抗-HBe(＋)，叫做血清转换。抗-HBe(＋)时，乙肝病毒在肝组织内的复制逐渐减少，由病毒复制活跃期转变成不活跃期，肝组织的炎症也常由活动变成不活动，血中及肝组织内病毒颗粒均减少，所以传染性也减少。但抗-HBe和抗-HBs不同，e抗体不是保护性抗体，不代表患者有了免疫力。有时虽然检查出e抗体阳性，但肝细胞内仍然可以查出乙肝病毒DNA，表明病毒仍然存在。大量研究表明，e抗体出现阳性是病毒复制降低并且传染减少的标志，但并不表示病毒已被消除。
       5、乙肝核心抗体（抗-HBc）。核心抗原虽然在血清中查不出来（在血中很快被裂解），但是它具有抗原性，能刺激免疫系统产生特异性抗体，即核心抗体，故检测抗-HBc可以了解人体是否有过核心抗原的刺激，也就是说是否有过乙肝病毒的感染。所以抗-HBc是一项病毒感染的标志。
12．界首市人民医院检验科     联系人：朱连见
免疫试剂中：HIV HCV HBsAg 几种试剂被定为”药”准字，请问是哪一年批下来的？是否合理？另外进口的同类产品为什么是”械”字号？
       张正教授：一些肝炎免疫试剂定为“药”字或“械”字是由食品药品监督管理局有关机构决定的。
13．甘肃省嘉峪关市第二人民医院检验科     联系人：曹瑞锋
小型医院传染病检测基本都用金标法，在日常工作中应该怎样做好质量控制？
       张正教授：金标法的质控与其他方法相同。
       （1）每日工作应有质控株（最好较界值稍高的标本）；
       （2）参加全国（或地方）室间质控。质控的时间、所用血清数量及质量应根据工作量自行规定。实验室自制的质控物最好经过标准品的校对定性。
      仲人前教授：首先选用国家相关部门已批准使用的试剂盒。使用前进行性能验证和评估。在每批使用过程中应有符合标准的室内质控。临床检测结果有疑义时应使用另一种试剂复查。
14．南京军区福州总医院分院检验科     联系人：张宝华
①部分特定蛋白如类风湿因子与抗“O”等，用生化分析仪做为什么不稳定？
②乙肝病毒基因分型即B型与C型检测过程中，遇到临介值如何判断？（复查后的结果似处于临介水平）。
       张正教授：①特定蛋白检测稳定性与方法关系较大，一般RF因子、抗链O在免疫仪器上多使用免疫散射比浊法，定量稳定，而化学分析仪的化学法对蛋白的测定：终点法或显色，不如侧酶学稳定。
       ②乙肝病毒基因分型遇到界值应用同一方法测，如复测后仍为界值，应改用其他方法重测。
       仲人前教授：①首先应观察该项目的当日质控是否在控，标线是否正确，以排除系统误差。观察标本的吸样量是否准确，排除检测的偶然误差。标本是否有黄疸、溶血等干扰因素。患者是否用药治疗等都可能导致结果不稳定。
       ②可以用测序的方法确证。或者建议患者几个月后复查。
15．孝感航天医院检验科     联系人：王斌
①C6、C12等蛋白质芯片技术可用于正常人群的筛查吗？
②HbA1C 项目可用于体检人群的筛查吗？
       张正教授：①C6、C12等肿瘤标志物筛查一般不应用于正常人群筛查。因为项目较多，针对性不强，对于结果的不正确解读易改被测者恐慌，如有临床可疑迹象应去相应专科系统检查。
       ②HbA1C 项目应用于体检时血糖超标患者复测时了解前一段时期血糖水平用。体检应先筛血糖。
       吴健民教授：①肿瘤的筛查有一个原则，即是对肿瘤高危人群进行筛查，而不是对正常健康人群进行筛查。目前我国专家提出的用肿瘤标志物进行高危人群筛查的，有以下几个方面：1、肝癌的高危人群筛查是，≥40岁的男性或≥50岁女性，具有HBV和/或HCV感染，嗜酒、合并糖尿病以及有肝癌家族史的人群，常规筛查指标主要包括血清甲胎蛋白(AFP)和肝脏超声检查(US)；2、前列腺癌高危人群筛查是，中、老年男性，筛查年龄可从50岁开始，如有前列腺癌家族史的男性，可从45岁开始，筛查应包括PSA检测和直肠指诊检查；3、卵巢癌高危人群筛查是，有遗传性卵巢癌综合征家族史的妇女，筛查年龄从绝经后开始，筛查可用血清CA125结合阴道超声检查。
       C6（癌症6项）包括AFP、CEA、CA19-9、CA125、CA15-3、PSA ；C12（癌症12项）包括AFP、CEA、CA19-9、CA125、CA15-3、CA242、tPSA、fPSA、NSE、β-hCG、铁蛋白（Fer）、人生长激素（HGH）等。蛋白质芯片检测的特点是，一次可同时测定6项或12项肿瘤标志物，由于它检测的项目多，许多医疗单位用它来进行正常人群的肿瘤筛查，但C6和C12蛋白质芯片检测的项目是固定的，不分男女，不分年龄，不分是否需要都测定同样的项目，实际上是不符合肿瘤高危人群筛查的原则的。
       ②美国糖尿病协会（ADA）发布的《糖尿病标准化诊治指南》（Standards of Medical Care in Diabetes) 2010版，将糖基化血红蛋白（HbA1C）≥6.5%与空腹血糖（FPG）≥7.0mmol/L和OGTT试验中2小时血糖≥11.1mmol/L作为糖尿病的诊断标准。HbA1C 测定的优点是无需禁食8小时以上；短期生活方式的改变不会影响HbA1c 的检测结果；HbA1c反映了患者体内近6～8周血糖的平均水平，是糖尿病诊断和判断血糖控制是否良好的重要指标。
       但目前我国的糖尿病诊断标准尚未修改，一个原因是缺乏中国人群的有关资料，另一个是HbA1c检测方法的标准化问题。
       至于糖尿病的筛查问题：糖尿病筛查的血糖标准和糖尿病的诊断标准是否应该一致？目前没有定论。筛查的目的是发现需要进一步检查或干预的对象，即糖尿病患者或高危人群，以利于糖尿病的防治。理论上糖尿病的筛查更侧重敏感性而非特异性，有人提出HbA1c＞6.0%为筛查阳性，属于高危人群，应行进一步检查和密切随访，这是一个值得研究和讨论的课题。因此，我认为在我国HbA1c 检测方法的标准化问题尚未完全解决前，暂不宜用HbA1c 进行大规模体检人群筛查，但可作为课题研究。
       仲人前教授：①蛋白芯片的确可以一次性检测多个项目，但由于成本等因素，我们实验室尚未开展，所以对其诊断准确性不可妄下结论。可以参考相关文献研究结果（侯晋轩，杨雪琴，陈创等。肿瘤标志物蛋白芯片中胃肠道恶性肿瘤相关指标的筛选优化。武汉大学学报：医学版，2008（5）：602-606.）。
       ②HbA1c 作为评价糖尿病患者血糖控制水平的“金标准”有多年历史，有关HbA1c 用于筛查和诊断糖尿病的议题一直是争议的焦点。2010年美国糖尿病学会（ADA）正式批准HbA1c 作为糖尿病的一种诊断方法。大量研究显示HbA1c是一个非常实用的筛查指标。HbA1c 的检测在世界范围内的标准化也初见成效。但是，国际上制定的HbA1c>6.5%的切点是否适合我国还有待积累循证医学证据，此外，HbA1c 的测定技术在我国尚未完全普及和标准化，医疗经济学问题也需评价。
仲人前教授推荐阅读书籍：
《慢性乙型肝炎防治指南》
《酒精性肝病诊疗指南》
《自身免疫性肝病诊断和治疗指南》
                                                                            摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第六期
                                                                                                       编辑：范伟伟