免疫肝病专家答疑（一）

钮留

       《临床实验室》由邮寄传真反馈方式发展至今的①网上在线（www.IVDchina.org）②e-mail、③邮寄、④传真等多种方式并行。反馈中包括读者对定向点金《临床实验室》的肯定，包括读者提出的意见与建议，更多的则是读者提出的与实际工作息息相关的检验问题。通过读者反馈，我们看到中国一线检验工作者希望通过《临床实验室》这个平台获得更多的理论知识与实际经验，希望获得更多资深检验专家与学者的帮助。针对本期免疫专题的出刊，组稿，我们甄选了2013年1月至5月读者反馈中有关免疫肝病方面的15个问题，邀请我国著名的检验专家张正教授、吴健民教授、仲人前教授对读者提出的问题做出交流和回答，希望通过三位专家的解答，对一线检验工作者的实际工作起到帮助。 如需进一步交流或有其他问题可发E-mail至ddm360@126.com。
       定向点金《临床实验室》对每一位读者提出的问题都会认真阅读，对相关问题结合杂志主题安排，邀请相关领域专家和公司技术人员做出回答。您提问题是对我们的信任，您提出的问题是构成杂志内容的基石，也是推动行业共同发展的动力。感谢您的信任和参与。
专家介绍

       张正：主任医师，教授，检验科主任。1966年毕业于北京医科大学医疗系（六年制）。1982年毕业于北京医科大学人民医院肝病研究所 获内科专业硕士学位。曾在日本东京都临床医学研究所亚洲肝病中心进修；后赴美国匹兹堡大学公共卫生研究生院从事微生物及传染病的实验室诊断研究。实验室研究方向：临床微生物分子生物学检验及临床意义研究，任中华医学检验学会常委及学会分子生物学专业委员会主任委员、北京分会副主任委员、中华医学管理学会临床检验专业委员会委员、卫生部标准化委员会检验分委会副主任委员、卫生部职称考试委员会（检验专业）委员、《中华检验医学杂志》主编、《临床检验杂志》特约编委、《中国实验诊断学》编委、《现代仪器》编委。

       吴健民：教授、主任医师、博士生导师。现任卫生部临床检验标准化专业委员会委员。曾任中华医学会检验学会常委、中华医学会检验学会肿瘤分会主任委员，中国免疫学会临床免疫专业委员会委员。1992年获国务院政府特殊津贴。1994年-1995年瑞士苏黎世大学医学院临床化学研究所高级访问学者。曾任华中科技大学同济医学院免疫研究所副所长，附属协和医院检验科主任。

       仲人前：医学博士，现任第二军医大学长征医院实验诊断科、全军临床免疫研究所主任、研究员、博士生导师。1984、1987、1991年分别获学士、硕士、博士学位。主要从事临床检验诊断学的教学、研究和医疗工作。主持各类科研基金20多项，其中，国家科技部863计划1项、国家自然科学基金5项、上海市重大或重点项目6项。发表论文200余篇，其中SCI论文50多篇，出版专著12部，授权专利6项，获军队科技成果奖3项，上海市科技成果奖4项。现任中华医学会检验医学分会副主任委员、上海市免疫学会理事长、全军检验医学学会副主任委员、全军医用标准物质学会副主任委员、中国抗癌协会肿瘤标志物分会副主任委员；曾任中国免疫学会临床免疫分会主任委员、上海市医学会检验医学分会主任委员等职务。
1. 武汉市石化医院检验科     联系人：李静
       免疫疾病往往病程长；每个人的体质不同，发展就不同。因医院规模有限，在工作中，实际病种往往只看到了病的开始、或者只见到了病程的后阶段；对于乙肝、丙肝病人怎样预防疾病向不佳的方向发展，这是我们遇到的最大困惑，谢谢。
       张正教授：乙肝、丙肝病人怎样预防疾病向不佳方向发展是每个患者、家属、医务工作者都关心的问题.由于每个患者的情况不同，需要根据各人情况制定生活、工作注意事项及诊疗措施。以下只对有共性的问题提些建议：
       (1) 生活、工作注意事项：生活必须有规律，避免过劳（如看电视、玩游戏超过夜间12点）。饮食基本应该清淡、禁酒、少油和刺激性食品。情绪稳定，尽量不要过急和激动。工作也应该注意作息规律。
       (2)诊疗方面要医患配合，定期检查肝脏酶学及免疫指标，据此提出药物种类和剂量。由于长程治疗清注意毒、副作用，在以上通用原则下还应制定个性化的具体措施。
       仲人前教授：一般说来，乙型肝炎约10～15%发展为慢性肝炎。丙型肝炎发展为慢性肝炎的比例更高，约40～50%。乙肝、丙肝感染影响预后的主要因素包括：
       1、感染病毒的年龄：这是目前所知影响预后的主要因素。一般来说，成年时感染乙肝病毒，造成急性肝炎发病者，一般恢复顺利；越小感染或是通过母婴垂直传播而感染者，越容易形成慢性肝炎，甚至终身携带病毒。
       2、病情的轻重：一般急、慢性乙肝，病变为轻度或中度，肝细胞实质损害不重，不会引起肝细胞大片实质性坏死，经休息、合理用药治疗后，病情多能控制；亚急性或急性暴发性肝炎，肝脏损害严重，肝细胞坏死并广泛溶解，并发症多，病死率高。
       3、是否伴有其他疾病：合并有其他疾病，如血吸虫病、胆管感染、糖尿病、肾病等，预后较差。
       4、妊娠：尤其妊娠晚期并发乙肝，或同时并发妊娠高血压综合症者，病死率高。
       5、性别：乙肝感染者男性比女性更易发生迁延性或慢性肝炎、肝硬化，预后差。
       6、免疫状态：患者免疫功能强，恢复较好，否则较差。
       7、治疗的早晚：早发现、早治疗，在医生的正确指导下，充分休息，合理饮食及用药，则预后较好。
       8、其他因素：急性期过劳、饮酒、滥用药物，手术创伤及营养不良等，均对肝脏有不良影响，可能使急性肝炎难以痊愈，转化为慢性肝炎；或慢性肝炎向重型肝炎、肝硬化演变。
       9、虽然丙肝临床症状相对较轻，但易向慢性化转变。长潜伏期和轻型或无黄疸型者，易发展为慢性；女性较男性更易发展为慢性；老年和高剂量丙肝病毒急性感染者易发展为慢性；经皮传播者，特别是输血后丙肝较非肠道外传播者更易发展为慢性，而且少数患者病情发展迅速，预后不良。
2. 金坛市人民医院检验科     联系人：唐国建
      肝炎标志物ELISA检测与化学发光法检测有何差异，如何解决？
       张正教授：肝炎标志物EIA检测与化学发光法主要差异是标记物不同而使后者较前者有更高的敏感性和特异性，但这不等于说目前诊疗水平应以发光全部取代EIA，发光法较EIA法昂贵。检验的不同方法选用讲适度。EIA法可适用于普通查体、一般治疗检测；发光法对于血制品筛查或临床高敏感度检测需求时应用。
       吴健民教授：酶联免疫吸附试验（ELISA）是灵敏度和特异性都很高的检测方法，其操作简单，方便，快速，可批量试验，在我国得到了广泛的应用，特别是在乙肝“二对半”的测定方面更是如此。但ELISA测定的一步法存在方法学不可避免的潜在缺陷，如双抗体夹心法可出现“钩状效应”，竞争抑制法可出现“不公平竞争”现象等，导致测定中出现假阳性或假阴性。
       为了避免“一步法”检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）出现“前带现象”，根据中华人民共和国卫生部行业标准“乙型肝炎表面抗原酶免疫检验方法”的要求，推荐使用酶免疫“两步法”进行检测。在检测中要严格按照试剂说明书的要求操作，这样才能得到比较满意的结果。任何操作方法的改进都要与原方法进行比较并获得良好的结果，同时还必须符合卫生部行业标准，否则，出了问题就不好交代了。
       由于上面提到的ELISA方法本身的缺陷，国产试剂的灵敏度，试剂的批间差，试验的环境，温浴的时间，洗板的次数，操作者的技能，酶标仪的质量等诸多因素，都会对结果产生影响。而化学发光法（CMIA）是自动化测定，测定的各种条件和程序是经过优化的，不受人为因素的影响，CMIA的固相载体对抗原抗体结合能力比较强，结合面积比较大，试剂的质量比较好，因此测定的灵敏度比较高，重复性比较好，这是它的优势，但其测定成本比较高，收费价格比较贵，这是它的劣势。ELISA检测与CMIA检测的优缺点是方法学本身造成的，很难解决。目前，ELISA法检测乙肝二对半，95%以上的结果是正确的，符合我国国情，可以满足我国绝大多数人群的需求，有争议的标本才考虑用CMIA检测。回过来说，所有免疫学方法测定乙肝“二对半”没有100%正确的，不管是ELISA法还是CMIA法，这也是免疫方法学的限制所决定的。
3．江西省人民医院检验科     联系人：邓荣春
①自身免疫性肝病的实验室诊断项目的开展及临床应用。
②脂肪肝、酒精性肝病有哪些特异性和灵敏度高的生化标志物？
       张正教授：①自免肝实验室诊断项目可包括：血常规、尿常规、肝脏酶学标志（ALT、AST、V-GT、ALP、TBIL、DBIL等），另还应注意免疫项目主要有ANA，抗双链DNA，IgG分型，蛋白电泳。另首诊时应排除乙肝、丙肝慢性感染及药物肝损害。
       ②脂肪肝可参考《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》（2010年1月修订）（中华内科杂志2010年3月第49卷4期19—33页）。
       吴健民教授：②脂肪肝可分为肥胖性脂肪肝，酒精性脂肪肝，糖尿病脂肪肝，药物性脂肪肝，营养不良性脂肪肝等，脂肪肝不是一种独立的疾病，是全身性代谢综合征的一种表现，主要通过B超来发现，没有特殊的生化标志物来协助诊断，如患者有脂肪肝同时伴有肥胖和血脂升高者，则可考虑为肥胖性脂肪肝。
       酒精性肝病是由于长期大量饮酒导致的中毒性肝损伤，最初表现为肝细胞脂肪变性（酒精性脂肪肝），进而发展为酒精性肝炎、肝纤维化，最终导致肝硬化。血清丙氨酸氨基转移酶（ALT），门冬氨酸氨基转移酶( AST)，γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT），碱性磷酸酶(ALP)等这些传统的肝功能检测项目，在酒精性肝炎时都可升高，但AST升高更明显，AST/ALT＞2。一般认为γ-GT是酒精性肝病比较敏感的生化指标，但肝癌、胆囊炎、胆结石、阻塞性黄疸时也都可明显升高，因此，从生化检验的角度来讲，目前尚没有诊断酒精性肝病特异性好、灵敏度高的生化指标。嗜酒史是诊断酒精性肝病的必备条件；肝活检对酒精性肝病有肯定的诊断价值，在肝小叶中央区肝细胞内见到酒精性透明小体（mallory小体），肝细胞的气球样变，伴有嗜中性粒细胞浸润，细胞坏死时可诊断为酒精性肝炎。
       仲人前教授：①自身免疫性肝病是一组由于机体自身抗体存在而引起肝组织持续损伤为特征的慢性肝病，主要包括自身免疫性肝炎（AIH）、原发性胆汁性肝硬化（PBC）和原发性硬化性胆管炎（PSC）。在排除各种肝炎病毒感染后，结合异常肝功能及自身抗体的检查能诊断多数自身免疫性肝病。
       1、自身抗体的检查。自身免疫性肝病患者的血清中常出现一些特征性的自身抗体，对于与其他各种肝炎鉴别诊断是极为重要的。其中ANA、SMA、LKM最为常用。常用的测定方法有间接免疫荧光法和免疫印迹法。
       1.1 抗核抗体（ANA）出现多核点型或核周型的荧光模式为PBC的特征。抗Sm抗体和抗SS-B抗体等抗ENA抗体也会在某些1型AIH 患者中出现。
       1.2 抗肝肾微粒体（LKM）抗体可分为针对不同靶抗原（LKM-1、LKM-2和LKM-3等）的亚型，这些靶抗原为一组细胞色素P450分子，抗LKM-1抗体与Ⅱ型AIH有关。
       1.3 抗肝细胞胞浆抗原1型抗体（LC-1）。抗LC-1抗体为AIHⅡ型的另一个特异性抗体，其阳性率大于 30%，在Ⅱ型AIH血清中可与LKM-1同时存在，也可单独作为诊断指标存在。该抗体的滴度与Ⅱ型AIH的疾病活动具有相关性，为AIH的疾病活动标志及预后指标。
       1.4 抗平滑肌抗体（SMA）对于诊断Ⅰ型AIH的特异性几乎达100%。
       1.5 抗可溶性肝抗原抗体（SLA）是Ⅲ型AIH的标志性抗体。
       1.6 抗线粒体抗体（AMA）有9种靶抗原M1-M9，抗M2抗体对PBC的诊断特异性最好（PBC 达96%），抗M4和M8的抗体在PBC中为55%，抗M9抗体在早期PBC患者（M2阴性）中阳性率达到82%。
       1.7 抗Sp100抗体。靶抗原为分子量100KD的可溶性酸性磷酸化核蛋白，该抗体在PBC中的特异性约为97%，其敏感性为10%-30%。该抗体对AMA阴性的PBC患者的诊断具有重要价值。
       1.8 抗gp210抗体。靶抗原为位于核孔复合物上的210kD跨膜糖蛋白，该自身抗体被一致认为是PBC的高度特异性抗体。抗gp210抗体的存在及抗体滴度一般不随患者诊断的时间及临床过程而变化，但抗体阳性与阴性患者的预后有显著性差异，抗体阳性提示患者预后不良，抗gp210抗体可作为PBC患者的预后指标。
       1.9 抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）在自身免疫性肝病中有一定的阳性率，但特异性不高，AIH为36%～83%，PBC为26%～39%，PSC为44%～67%，以核周型为主。尽管对于PSC也只有中等的敏感性和特异性，但至今仍然是此病的唯一血清标志。
       2、肝功能检测
       2.1 酶类检测 ALT持续反复增高，为正常的3～5倍以上，且ALT>AST，GGT、ALP亦有不同程度的增高。
       2.2 蛋白类检测 白蛋白正常，球蛋白增高（γ-球蛋白），以IgG增高最为明显，其次为IgM、IgA。
       2.3 血清胆红素明显增高。
②脂肪肝、酒精性肝病的生化指标包括
       1、血清酶学检查
       1.1 ALT、AST：一般为轻度升高，达正常上限的2～3倍。酒精性脂肪肝的AST升高明显，AST/ALT>2有诊断意义。非酒精性脂肪肝则ALT/AST>1。
       1.2 γ-GT、ALP：酒精性脂肪肝时γ-GT升高较常见，ALP也可见升高，达正常上限的2倍；非酒精性脂肪肝患者γ-GT可以升高。
       1.3 GST：可反映应激性肝损伤，较ALT更敏感。
       1.4 谷氨酸脱氢酶(GDH)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(OCT)：脂肪肝时两酶都升高。尤其是酒精性脂肪肝，GDH/OCT>0.6。
       1.5 胆碱酯酶(CHE)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)：80%脂肪肝患者血清CHE和LCAT升高，但低营养状态的酒精性脂肪肝升高不明显。CHE对鉴别肥胖性脂肪肝有一定意义。
       2、血浆蛋白变化
       1.1 β球蛋白，α1、α2、β脂蛋白多升高。
       1.2 白蛋白多正常。
       1.3 肥胖性脂肪肝时，LDL-C升高，HDL-C显著降低，Apo B，ApoE，Apo CⅡ和Ⅲ升高。
       3、血浆脂类：TG、FA、胆固醇、磷脂常升高，其中胆固醇升高显著，常>13mmol/L。
       4、胆红素：严重脂肪肝时可有血胆红素升高，轻中度脂肪肝胆红素多正常。
       5、凝血酶原时间(PT)：非酒精性脂肪肝多正常，部分可延长。
       6、血胰岛素水平呈高反应延迟型，糖耐量曲线高峰上升，下降延迟。
       7、血尿素氮、尿酸偶见升高。
4．内蒙古呼伦贝尔大雁医院检验科     联系人：王敬新
      现在乙肝表面抗原试剂改成了两步法，检测时间大大延长。有没有什么好的方法试剂来代替。同时别的同行有的仍旧采用原来一步法加各种试剂，只是孵育时间还是按照两步法操作，这样可以么？
       张正教授：乙肝酶标检测法最早使用两步法后为缩短报告时间改为一步法。后者没有给抗原-抗体的结合以充分时间，反应不完全，易造成错误结果。实践证明一步法是有缺陷的。检验的质量是检验的生命，以牺牲检验质量换取快速报告是错误的。提问者在问题中谈到以一步法加各种试剂只延长孵育时间代替二步法的实质仍是一步法，建议不在实验室使用。乙肝检测二步法操作应严格按SOP执行。任何改良要作对比实验后才能评价。
       仲人前教授：乙肝表面抗原试剂改两步法，主要是为了提高灵敏度，减少灰区值。除手工法外，还有很多自动化分析的方法检测乙肝表面抗原，如雅培，罗氏，索灵，Wallac1235全自动时间分辨免疫分析仪等，各有优缺点，可根据实际情况选用。ELISA一步法由于反应时间短，可能导致弱阳性标本因反应不完全使灵敏度降低而漏检。有研究报道[龚跃云，欧阳芳，吴豫。新两步法和一步法检测乙肝表面抗原的比较。临床输血与检验，2012,14（3）：241-243.]一步法与新两步法有较好的一致性，仍须在检测过程中注意HOOK效应和处于灰区的标本，应用不同的免疫方法进行复查或用中和实验进行确认。
5、湖北医药学院附属东风总医院检验科 联系人：李毅
①原发性肝癌血清标志物研究进展；
②自免肝的诊断与相关自身抗体的检测进展。
6、南通市第一人民医院检验科     联系人：陶国华
自身免疫性肝病诊断项目的优化。
       吴健民教授：①肝癌血清标志物有蛋白类标志物，如甲胎蛋白（AFP） 、甲胎蛋白异质体（AFP-L3） 、高尔基体蛋白7 3（GP73）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）、脱-γ-羧基凝血原（DCP）、骨桥蛋白（OPN）、α-L-岩藻糖苷酶（AFU）、γ-谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ（γ-GT Ⅱ）、热休克蛋白（HSP）等，还有细胞因子类，核酸类标志物类，micro RNA，DNA甲基化等。其研究进展请阅读中华检验医学杂志2013年第3期P.212，房萌和高春芳的综述“肝细胞癌诊断标志研究与临床应用新进展”。
       仲人前教授：①原发性肝癌血清标志物研究进展
       1、目前诊断原发性肝癌最重要的肿瘤标记物为AFP，但其敏感性和特异性相对较差，并且存在假阳性，因此需联合几种标记物和影像学进行诊断。有文献提出AFP的异质体AFP-L3与肝功能不佳、肿瘤低分化程度以及生物学恶性行为相关，该异质物有可能成为比AFP更好的预后预测标记物。
       2、异常凝血酶原DCP，产生于肿瘤细胞的不正常的凝血酶原。肝病可以引起AFP水平的增高，但不能导致DCP的增高，因此DCP诊断HCC比AFP更具特异性。
       3、岩藻糖苷酶AFU，在HCC患者中其血清活性较肝硬化、慢性肝炎等良性肝病及健康对照组有明显升高，对直接小于2cm 的HCC敏感性要高于AFP。
       4、高尔基体蛋白73（GP73），研究报道肝癌患者血清中GP73表达升高，可能成为诊断早期肝癌的标志物。
       5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)，可以在40%的HCC患者血清中检测到，而在肝硬化、慢性肝炎和健康成人血清中未测到。
       6、肝细胞生长因子HGF。有研究表明肝癌患者血清HGF浓度明显高于慢性肝炎及肝硬化而无肝癌的患者，且HGF 浓度大于0.6μg/L的患者均患有肝癌，而血清AFP浓度并不一定升高。
       7、热休克蛋白27，在肝组织中广泛表达，可能与肝癌的发生发展有密切联系，在临床肿瘤的早期诊断、细胞分化及疾病的进展转移判断等方面具有极大的参考作用。
       8、骨桥蛋白OPN，是一种具有多种生物学功能的糖蛋白。可能在恶性肿瘤的诊断方面有价值，还与肿瘤的浸润、转移密切相关，有可能作为监测肿瘤预后的指标。
       9、DKK1蛋白：新近的一项多中心大规模的临床研究显示DKK1蛋白可作为肝癌诊断的一个很好的指标，研究成果发表于国际著名医学杂志《柳叶刀.肿瘤学》（Qiujin Shen,Jia Fan,Xin-Rong Yang,et al. Serum DKK1 as a protein biomarker for the diagnosis of hepatocellular carcinoma:a large-scale multicentre study. Lancet oncology,2012,13(8):817-826.）。
       ②自免肝的诊断与相关自身抗体的检测进展。
       自身免疫性肝病诊断项目的优化。
       1、自身免疫性肝炎（AIH）的实验室诊断要点: 存在肝炎的血液生化检验及病理学证据，血清碱性磷酸酶不如血清转氨酶增高明显；存在相关的自身抗体及高丙种球蛋白血症（初期主要表现为血清IgG升高），血沉增高；一般各型肝炎病毒感染的血清学指标阴性，但要注意与病毒性肝炎的重叠；患者有遗传倾向，可表达HLA-B8、DR3或DR4抗原；免疫抑制治疗后症状减轻，应排除药物性肝病、酒精性肝病、代谢性肝病，以及PBC和PSC，但需注意它们的重叠综合征。自身抗体如ANA、SMA、LKM、SLA等对AIH的诊断具有很重要的意义。
       2、原发性胆汁性肝硬化（PBC）的实验室诊断要点: 存在多核点型的抗核抗体以及AMA为其最重要的特征，高滴度的AMA-M2自身抗体通常具有重要诊断价值；同样也存在高丙种球蛋白血症；此外，血清胆固醇和脂蛋白、血清结合珠蛋白和血清胆红素浓度增高以及血管紧张素转化酶活性增高都是该病的特有表现。抗M4和抗M8抗体见于PBC晚期，抗M9则见于PBC早期且预后良好。
       3、原发性硬化性胆管炎（PSC）的实验室诊断要点: 高丙种球蛋白血症，成年患者以IgM为主，但儿童患者却多为IgG升高。大约有60%～80%的患者表达HLA-B8（对照为25%），70%～75%表达HLADR3（对照为19%）。该病患者相当比例并发溃疡性结肠炎（约60%），呈进行性病变，大约有84%的患者pANCA阳性，且滴度很高（平均为1：1000），可能与疾病的活动有关。患者CIC、C3、C4、肝脏酶谱和胆红素一般都增高。此病的诊断需排除胆道其他疾病（如胆结石）。
                                                                                       摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第六期
                                                                                                                  编辑：范伟伟