丙型肝炎病毒核心抗原实验室检测及其临床意义

姑姑机

陈新月1，窦晓光2，Dale Hu3，高峰4，高省5，华文浩6，贾继东7，蒋岩8，John Klena3，鲁凤民9，卢胜男10，欧启水11，魏来12，汪宁8，徐英春13，殷鹏14，张继明15，赵秀英16，庄辉9
1、首都医科大学附属北京佑安医院特需病房科；
2、中国医科大学附属第二医院盛京医院感染科；
3、美国疾病预防控制中心；
4、上海交通大学附属第六人民医院检验科；
5、美国雅培诊断中国区科学事务部；
6、首都医科大学附属北京地坛医院检验科；
7、首都医科大学附属北京友谊医院肝病研究中心；
8、中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心；
9、北京大学医学部基础医学院病原生物学系和感染病中心；
10、台湾高雄长庚医院胃肠肝胆科系；
11、福建医科大学附属第一医院检验科；
12、北京大学人民医院；
13、北京协和医院检验科；
14、美国雅培诊断科学事务部；
15、复旦大学附属华山医院感染病科；
16、首都医科大学附属北京佑安医院检验科

       丙型肝炎病毒（HCV）感染的实验室诊断包括抗-HCV、HCV核酸（HCV RNA）和HCV核心抗原检测。抗-HCV检测有筛查试验如酶免疫法（EIA）和化学微粒发光法（CMIA），以及补充试验如重组免疫斑点试验（RIBA）。抗-HCV抗体出现较晚，且在HCV感染治愈或康复后仍可持续阳性，因此，抗-HCV不能作为HCV感染的早期诊断，也不能区分是既往感染抑或现行感染，也不能预测和监测抗病毒治疗的效果；HCV RNA检测操作技术要求较高，需要特殊的仪器设备和有较高专业技术水平的工作人员，且费用相对较高，耗时较长，在操作过程中易发生污染而出现假阳性，在一些基层医疗单位难以开展。
       HCV核心抗原检测是新近发展的一种HCV感染的检测方法。由于感染HCV后，HCV核心抗原出现较早，且与血清中HCV RNA载量呈正相关，并在HCV感染治愈或康复后消失，因此，可作为HCV感染的早期诊断、献血员筛查、慢性HCV感染诊断、高危人群监测、免疫功能障碍患者的HCV感染诊断、鉴别既往感染抑或现症感染，并可用于抗病毒疗效的预测和监测。
1 丙型肝炎核心抗原检测试剂的发展历程
       1992年Takahashi 等用HCV感染者血浆进行溴化钾浓度梯度离心，提取浓度为1.115g/ml的病毒分离液，在吐温80中脱去病毒脂质外壳，在反应槽中与HCV核心蛋白单克隆抗体结合，用免疫电镜技术直接观察到直径为33nm的正二十面体HCV核心蛋白颗粒，而HCV阴性对照血清中无此33nm颗粒。
       1995年Tanaka等应用免疫荧光法检测，用识别核心抗原41~60位氨基酸片段的5F11单克隆抗体包被反应管，与离心后的HCV阳性血清在37℃下孵育10min，用缓冲液洗涤后，加入β-D-半乳糖苷酶标记的识别HCV核心抗原21～40位氨基酸片段的5E3单克隆抗体，然后加4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷为底物显色。该法灵敏度高于免疫电镜技术，但标本前处理仍较复杂，从而限制其在临床应用。
       1999年Ortho公司研制成功第一代商品化HCV核心抗原酶免疫试剂（EIA），采用5F11和5E3两种单克隆抗体包被微孔板，然后加被检标本，如标本中含有HCV游离的核心抗原，即可检测到。但当机体出现抗-HCV抗体后，血液中的核心抗原主要以抗原抗体复合物的形式存在，该试剂无法检出。
       2000 年Ortho公司研制成功第二代HCV 核心抗原酶免疫试剂（tra-C）。该法先用裂解液裂解HCV核心抗原抗体复合物，可同时检测到游离的及与抗体结合的HCV核心抗原；简化了标本的前处理步骤，由原来的6步法简化为1步法；可定量检测HCV核心抗原。
       2005年Abbott公司研制成功HCV抗原和抗体联合检测试剂MurexHCV Ag/Ab Combo。该试剂通过2步法EIA同时检测HCV核心抗原和抗-HCV。2009年该公司研制成功第三代HCV核心抗原检测试剂（ARCHITECT HCV Ag Reagent Kit），即化学微粒发光法（chemiluminescent micropartical immunoassay，CMIA）代替酶免疫法，并实现了自动化。2009年获得欧洲统一认证（Conformity with European，CE认证）。2012年获得中国食品药品监督管理局（SFDA）认证。该试剂盒的灵敏度为0.06pg/ml（3fmol/L），较Ortho trak-C EIA试剂盒高25倍；整个检测时间为36min，明显短于HCV RNA检测。HCV核心抗原定量检测结果与HCV RNA定量高度相关。
2 HCV核心抗原检测的灵敏度和特异度
       Veillon等应用Ortho track-C EIA试剂盒检测世界卫生组织（WHO）HCV RNA 96/790标准品血清中HCV核心抗原浓度，结果为5.30pg/ml，对应的HCV RNA水平为38,827IU/ml（HCM v2.0）。该试剂盒的检测下限为1.48pg/ml，对应的HCV RNA水平为9.7071IU/ml（HCM v2.0）。
       ARCHITECT HCV核心抗原检测试剂盒（CMIA）的灵敏度和特异度明显高于track-C。Morota等比较了ARCHITECT HCV Ag和Amplicor HCV Monitor RNA检测结果，发现ARCHITECT HCV核心抗原检测浓度下限为0.0038～0.055pg/ml（1.88～2.77fmol/L）。检测HCV基因型1~3型的标本表明，其灵敏度和特异度不受基因型影响。Mederacke等报告，ARCHITECT HCV核心抗原检测下限为3fmol/L，其对应的HCV RNA载量分别为：507IU/ml（基因型1a）、405IU/ml（基因型1b）、600IU/ml（基因型2）、771IU/ml（基因型3）。2010年澳大利亚国家参比实验室（NRL）用ARCHITECT HCV核心抗原试剂盒检测丙型肝炎患者未稀释的血清标本，发现当血清标本中HCV RNA载量＞1,000IU/ml时，HCV核心抗原检测的灵敏度为95%，特异度为99.88%。
       Blatt等检测美国6,807例慢性HCV感染者血清中HCV RNA载量，基因型1、2、3和混合基因型感染者的血清HCV RNA平均水平分别为3.2×106、2.7×106、2.5×106和3.3×106IU/ml。Fytili等对德国6,102例抗-HCV阳性丙型肝炎患者的血清标本检测HCV RNA载量，HCV RNA>10,000IU/ml分别占94%（CobasAmplicor TM）和86.5%（m2000 Real Time）。2011年Medici等报告，丙型肝炎患者血清HCV RNA载量在10,000IU/ml以上时，ARCHITECT HCV核心抗原检测的灵敏度为97.1%。有研究显示，当丙型肝炎患者血清HCV RNA载量在6,000IU/ml以上时，HCV核心抗原检测的灵敏度为100%。
       ARCHITECT HCV核心抗原定量检测结果与HCV RNA载量间高度相关，相关系数为0.614～0.984。Mederacke等对109例丙型肝炎患者118份血清标本同时检测HCV核心抗原和HCV RNA载量，结果两者在基因型1、2、3患者中均呈高度相关，相关系数分别为0.72、0.77和0.73。Ross等对385份丙型肝炎患者血清标本同时检测HCV核心抗原（Abbott ARCHITECT）和HCV RNA（bDNA），两者的相关系数为0.857。Park等对127例丙型肝炎感染者的临床血清标本进行HCV RNA载量（Cobas Taqman）和HCV核心抗原浓度（Abbott ARCHITECT）的相关性研究，结果发现两者的相关系数分别为0.9521（基因型1，n=76）、0.9513（基因型2，n=45）和0.9429（基因型3，n=6）。Shen等报告，在HIV/HCV合并感染者中，HCV核心抗原水平与HCV RNA载量也呈明显正相关，但与CD4+ T细胞呈负相关。
3 丙型肝炎核心抗原检测试剂的临床应用
3.1 HCV感染的早期诊断
       人感染HCV到产生抗-HCV的平均时间约60d，被称为抗-HCV的窗口期。但HCV核心抗原于HCV感染后12～15d即可检测到，较抗-HCV出现提前5～7周。Peterson等报告，HCV核心抗原的出现时间仅较HCV RNA晚1d。因此，HCV核心抗原筛查可作为HCV感染的早期诊断。
3.2 用于献血员筛查
      Lee等检测血液中心128例HCV窗口期感染的血液标本（抗-HCV阴性，HCV RNA阳性），结果HCV核心抗原的检出率为94%。Brojer等检测波兰14.4万例血液中心的血标本，2例HCV核心抗原阳性。因此，波兰考虑将HCV核心抗原作为常规献血员筛查项目之一。目前，克罗地亚已将HCV核心抗原作为献血员筛查项目之一。
3.3 抗-HCV补充试验
       我国《丙型肝炎病毒实验室检测技术规范（试行）》指出：对初筛呈阳性反应的样品，应用原有试剂双孔或原有试剂加另一种不同原理（或厂家）试剂进行复检，如呈一阴一阳反应者，应进行补充试验。目前常用的补充试验系用RIBA，如Chiron RIBA HCV 3.0 SIA抗HCV确证试剂（RIBA）和新加坡MP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd公司生产的丙型肝炎病毒抗体补充试剂盒（蛋白印迹法）（HCVBlot 3.0，简称MP），但该法价格较贵，操作较复杂，一般实验室不开展此试验。因此，对这些抗-HCV呈一阴一阳反应性标本可检测HCV核心抗原，如HCV核心抗原阳性，可确证抗-HCV为真阳性；但如HCV核心抗原阴性，不能确证抗-HCV为阴性，需进一步检测HCV RNA，如HCV RNA阴性，仍不能确证其阴性，还需用RIBA试验确证，如RIBA试验阴性，则定为抗-HCV阴性；如RIBA阳性，则定为抗-HCV真阳性。因既往感染HCV康复者，其抗-HCV可持续阳性，但HCV RNA和HCV核心抗原为阴性。
3.4 慢性HCV感染诊断
       如抗-HCV持续阳性6个月以上，血清HCV核心抗原阳性，可确证为HCV慢性感染。如免疫功能障碍患者，抗-HCV可能阴性，但HCV核心抗原阳性，病程超过6个月者，也可诊断为HCV慢性感染。
3.5 高危人群监测
       丙型肝炎的高危人群如血透析患者、静脉内注射毒品者、男男性接触人群、性工作者、性病患者和器官移植患者等，感染HCV的危险性较高，对他们定期检测HCV核心抗原，可早期发现HCV感染。如爱尔兰将HCV抗原检测列入血透析常规监测项目，于透析前和透析后每3个月对血透析患者进行HCV核心抗原检测。
3.6 用于免疫功能障碍人群的HCV感染诊断　
       HCV感染者、器官移植患者、肿瘤患者、先天性免疫功能不全者、维持血液透析者等，其免疫系统受损或抑制，因此，在感染HCV后，抗-HCV出现时间延迟，甚至不产生，但血液中可检测到HCV核心抗原。Delladetsima等对17名肾移植前检测不到抗-HCV或移植后抗-HCV阳转，但均为HCV RNA阳性者，肾移植后平均随访（7.2±4.2）年，肝活检显示5例为急性肝炎，9例为慢性肝炎，9例为胆汁淤积性肝炎并有肝纤维化，结果发现，肾脏移植后急性肝炎患者每年肝纤维化发生率为77%；慢性肝炎患者每年肝纤维化发生率为35%；其中有2例患者始终未产生抗-HCV，但HCV核心抗原阳性。因此，HCV核心抗原检测可作为上述人群HCV感染的诊断。
3.7 鉴别HCV既往感染抑或现症感染
       HCV感染治愈或康复后，HCV抗体持续阳性，而HCV抗原消失。因此，同时检测HCV抗原与抗体，可以鉴别是既往感染抑或现症感染。Park等报告，在282例临床就诊患者的血清标本中，48例抗-HCV阳性而HCV核心抗原阴性，HCV RNA也为阴性，说明为HCV既往感染者，不是活动性HCV感染者。检测125例HCV核心抗原阴性的标本，121份（96.8%）HCV RNA也为阴性，仅4份HCV RNA阳性，表明两者相关性良好。Kesli等检测212例患者血清抗-HCV、HCV核心抗原和HCV RNA，结果38例抗-HCV阳性，但HCV核心抗原和HCVRNA均阴性，可排除现症感染。在160份HCV RNA阳性标本中，154份（96.25%）HCV核心抗原也为阳性。
3.8 用于抗病毒疗效的预测和监测
       Ross等报告，在聚乙二醇化干扰素α和利巴韦林联合治疗的丙型肝炎患者中，第12周HCV核心抗原水平下降大于2lg fmol/L与HCV RNA下降大于2lg IU/ml可预测持续病毒学应答（SVR），两者得到的SVR阳性预示值和阴性预示值一致。有研究报道，应用聚乙二醇化干扰素α-2a和利巴韦林联合治疗丙型肝炎患者42例，治疗至第2周时，HCV核心抗原水平较治疗前下降2lg fmol/L，预测SVR的阳性预示值为83%，阴性预示值为95%。Moreno等对176例接受抗病毒治疗的慢性丙型肝炎患者血清中检测HCV核心抗原，发现有SVR的71例患者仅有3例（4.2%）血清HCV核心抗原阳性［平均浓度为(（7.7±6.8）pg/ml］，而病毒学无应答（NR）的患者中，98%（43/44）HCV核心抗原为阳性［平均浓度为（72.6±7.9）pg/ml］。在治疗前HCV核心抗原浓度越低，出现SVR的概率越高。Vermehren等报告，治疗后出现快速病毒学应答（RVR）的患者，其治疗前血清HCV核心抗原浓度较未出现RVR的患者低（2.3lgfmol/L vs 3.5lg fmol/L），而出现SVR的患者，其治疗前血清HCV核心抗原浓度也较未出现SVR者低。慢性丙型肝炎患者治疗前HCV核心抗原水平与HCV RNA载量呈正相关（r=0.92，P<0.01），如患者在抗病毒治疗1周后，血清中未检出HCV核心抗原，于治疗第4周时，HCV RNA未检出的可能性为90.9%。获得RVR的患者中，95.5%可实现SVR。如患者于治疗2、4和12周时HCV核心抗原浓度与基线水平相比，下降<1lg，则治疗无应答的预测值分别为54.9%、78.7%和100%。但由于目前ARCHITECT HCV核心抗原试剂的检测下限为3fmol/L，其对应的HCV RNA载量为507～771IU/ml，因此，不能作为停药的标准。
                                                                                                      本文经庄辉院士授权转载
                                                                                      摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第六期
                                                                                                               编辑：范伟伟