Roche电化学发光免疫法检测NT

司徒凌楚

  中山大学附属中山医院检验医学中心    索明环，张秀明，温冬梅，王伟佳，李飞，欧阳能良，阚丽娟，严海忠
       摘要：目的  探讨电化学发光免疫法检测N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)的检测限值和功能灵敏度。方法  参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)Ep-17A文件制备空白样品及系列低浓度样品。空白样品采用配套的稀释液，系列低浓度样品采用倍比稀释的方法获得。样品制备后用Roche Cobas E601电化学发光免疫系统检测NT-proBNP浓度，以确定该方法的空白限、检出限和功能灵敏度。结果  NT-proBNP的空白限为2.53 pg/ml，检出限为7.75 pg/ml，10%CV时的功能灵敏度为8.82 pg/ml。结论  建立了Roche Cobas E601电化学发光免疫系统检测NT-proBNP的空白限、检出限和功能灵敏度，为临床诊断和治疗提供了更有价值的信息。
       关键词：N末端B型利钠肽原；电化学发光免疫法；空白限；检出限；功能灵敏度

       N末端B型利钠肽原(Nterminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP)检测作为一种方便、有效的手段被越来越多的应用于心源性/肺源性急性呼吸困难的鉴别诊断[1]、心力衰竭CHF 的危险分级及预后评估等方面[2]，并已被美国心脏学会(AHA)[3]等机构列入相应的“心力衰竭”诊断指南中。目前，血清NT-proBNP的定量检测国内外主要采用Roche Elesys电化学发光免疫分析系统，包括Elesys 1010，Elesys2010，E170和Cobas E601等，其中Cobas E601是最新一代的电化学发光免疫分析系统。按照医学实验室认可标准ISO15189和《临床实验室管理办法的要求》，实验室必须对其主要分析性能进行验证或评价，证实其能够达到临床检测所要求的质量后方可用于临床检测。本研究主要参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)的EP-17A[4]文件，对Roche Cobas E601电化学发光免疫分析系统检测NT-proBNP的空白限(Limit of blank，LoB)、检出限(Limit of detection，LoD)和10%CV 时的功能灵敏度(functional sensitivity，FS)进行评价，旨在为临床提供更可靠的诊断信息。
1 材料和方法
1．1 材料
       1．1．1 检测系统的组成：Roche Cobas E601电化学发光分析仪及配套NT-proBNP检测试剂盒(批号：157123)，Roche公司通用稀释液(批号：15592203)，配套2水平校准品(批号：156070，采用厂家推荐校准频次)及2水平质控品(批号：155039，155040)。
       1．1．2 样品制备：用Roche公司通用稀释液做空白样品以确定空白限。收集康体保健中心18～24岁正常男性血清10 ml，备用。用稀释液对低浓度正常人血清做系列稀释，制备浓度为2.5，5.0，7.5，8.5，10.0 pg/ml系列样品，用来确定LoD和FS。
1．2 方法
       1．2．1 实验前准备：每天对仪器进行维护保养、质量控制，并执行定期校准。
       1．2．2 LoB试验：用仪器专用稀释液做空白样品，每天检测2批，每批重复检测6次，连续5天，记录光量子值，共获得60个结果。由于Roche Cobas E601检测系统厂商声明的灵敏度为5.0 pg/ml，浓度小于5.0 pg/ml时仅提供光量子值，本实验通过拟合公式将光量子值转化为浓度值。按国际标准化组织的要求，在规定I 类错误水平a=5%的条件下，确定LoB。若数据呈正态分布，则采用参数方法估计LoB。若数据呈非正态分布，则采用非参数检验，将空白样品的结果由小到大排序，第95百分位数值即为LoB。
      1．2．3 LoD试验：收集无溶血、无黄疸、无脂浊的18～24岁正常男性血清10 ml，3 500 r/min离心10 min，取600ul 在Roche Cobas E601系统上重复测定3次，结果分别为10.62，10.26，9.59 pg/ml，取均值10.16 pg/ml 作为测量值。按照EP-17A文件对LoD实验样品的浓度范围应在LoB 1～4倍之间的要求，用专用稀释液对上述血清做系列稀释，制备预期浓度为2.5，5.0，7.5，8.5，10.0pg/ml的系列样品，分装，-20℃贮存备用。将这些样品每天上、下午各检测1批，每批重复检测2次，共进行5天，记录其光量子值和浓度值。按国际标准化组织的要求，在规定Ⅱ类错误水平β=5%的条件下，确定LoD。若数据呈正态分布，则采用参数方法估计LoD。若数据呈非正态分布，采用非参数方法估计LoD，是低浓度样品测定中位数和第5个百分位数的间距。
       1．2．4 FS试验：样本制备和实验方法同LoD。依据临床化学实验室心衰标志物指南对NT-proBNP测定不精密度CV≤10%的要求[5]，对系列低浓度样品进行检测，计算均值、标准差和变异系数，CV最接近10%的实验样品所具有的分析物含量即为功能灵敏度。
2 结果
       2．1 空白限(LoB)  仪器直接给出的所有空白测定结果均小于5 pg/ml。根据测定的光量子值，经拟合转换成具体的数值。经正态分析，数据呈非正态分布，故采用非参数检验，将空白样品的结果由小到大排序，第95百分位数值即为LoB。根据公式得出第95百分位数为第57.5。表1为空白样品第51～60位的检测结果。第57.5位的结果为(2.48+2.57)/2=2.53 pg/ml，即LoB为2.53pg/ml。

       2．2 检出限(LoD)  系列低浓度样品测定结果见表2。经正态分析，数据呈非正态分布，故采用非参数检验。将所有结果由小到大排序，第1～10位和第21～30位的结果见表3。中位数为第255位置结果即(6.50+6.83)/2=6.67 pg/ml，第5百分位数值为第3位置结果即1.45 pg/ml，按下式计算LoD：
Ds．β =6.67—1.45=5.22 pg、ml，LoD=LoB+Ds．β =2.53+5.22=7.55 pg/ml。

       2．3 功能灵敏度(FS)  分别计算5个低浓度空白样品测定结果的平均值、标准差和变异系数(CV)，结果见表2。按照NT-proBNP检测不精密度CV≤10% 的质量要求，由表2可以看出，在浓度为8.82 pg/ml下，日间CV为9.62%，最接近10%，故FS为8.82 pg/ml。

3 讨论

       2004年，美国CLSI发表了《确定检出限和定量检测限的方案》即EP-17A文件，该文件对如何确定或验证定量检验方法的空白限和检出限，如何正确使用和解释各种限值，以及如何基于实验室在低浓度处的性能目标确定定量检测限提出了建议。Roche Cobas E601是最新一代的电化学发光免疫分析系统(其上一代产品为Elecsys E170)，按照IS015189和《临床实验室管理办法》的要求，实验室必须对其主要分析性能进行验证或评价，证实其能够达到临床检测所要求的质量后方可用于临床检测。本研究基于EP-17A文件要求，进行了灵敏度实验。本实验中60个空白样品的检测结果均小于5.0 pg/ml，验证了厂商声明的检测限小于5 pg/ml的结论。同时通过对空白样品和低浓度样品的检测得出NT-proBNP检测的空白限为2.53 pgml，检出限为7.75 pg/ml，功能灵敏度为8.82 pg/ml。
       然而，其他研究人员也做了相关的实验。Rawlins等[6]分析了Roche E170检测NT-proBNP的分析灵敏度，重复测定了10次空白样品和3次浓度为140pg/ml的样品，以140 pg/ml的样品为标准，通过计算得到的空白限(分析灵敏度)为3.0 pg/ml，低于厂商声明的5.0 pg/ml。Prontera等[7]采用平均斜率法研究得到，Elecsys 2010检测NT-proBNP的检测低限(相当于空白限)为4.2pg/ml。Yeo等[8]在2003年评价了Elecsys 1010，Elecsys2010和E170的功能灵敏度，通过单次幂回归得到3个检测系统的功能灵敏度约为30.0pg/ml。国内屠强[9]用稀释试验做罗氏Elecsys 2010灵敏度分析，用实测值和理论值进行比较得到灵敏度为5.4 pg/ml。本研究得到的Roche Cobas E601空白限为2.52 pg/ml，功能灵敏度为8.82 pg/ml，与以上报道不完全一致，这可能与分析灵敏度的定义、所采用的试验和统计方法以及设定的质量标准不同有关。
       目前评价分析灵敏度的方法有多种，并且每种分析方法的结果也不完全一致，并且存在很多概念和概念上的交叉[10]，应用比较混乱，迫切需要一个统一的标准来规范分析灵敏度的评价方法。美国CLSI EP-17A文件对如何确定和验证空白限、检出限提出了具体的要求和实验方法，被不少学者认为是评价分析灵敏度较为可靠的方法，但在实验过程中，发现该文件明显存在一些局限性，比如测试数太多，对于临床实验室成本比较高，并且规定在确定LoD时低浓度样品应介于LoB的1～4倍之间，但没有规定具体的浓度间距以及每一个样品重复测定的次数，这就对实验结果造成明显影响，使各个实验室的评价不具可比性，故CLSI EP-17A文件需要进一步的完善和补充。

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                                                                                                编辑：范伟伟