温育和洗板方式对ELISA测定结果的影响

沉默

        同济医科大学附属荆州市中心医院检验医学部    汪永红，李军，王昌富，江涛，张国良，高清萍，王植雄
       摘要：目的 了解ELSA操作过程中温育和洗涤方式对测定结果的影响。方法 以HBsAg为例将样本应用样本分配仪加入微孔板，然后将通过不同的温育、洗涤方式、处理后检测样本的吸光度（A）值。结果 全自动酶标仪和手工洗涤方式测定的HBsAg低值阳性标本有显著性差异（P<001）；37℃干式温箱温育和37℃水浴结果没有明显差异。结论  全自动酶标仪一体化检测效果为佳；温育方式对实验无明显干扰；如果对实验各环节进行标准化，排除潜在的影响因素，可以最大限度地降低检测的系统误差，以保证ELISA 检测有较好的准确性。
       关键词：ELISA；温育；洗涤

       临床常用ELISA 法进行HBV-M 的检测作为判断乙肝病毒感染、传染及愈后的指标。因操作简便，费用低廉，在临床实验室应用极为广泛。但影响ELISA结果的因素较多，如试剂、全自动设备、手工检测、操作步骤、反应的温度、洗板的方式和显色时间长短等等［1］。本文以测定HBsAg为例，讨论温育和洗涤方式对ELISA 法检测结果的影响。
资料与方法
1 材料
       （1）样本来源 随机收集门诊乙肝病人HBsAg 高值阳性血清、低值阳性血清和阴性血清。0.5ng/ml HBsAg 临界值血清购自卫生部临检中心。
       （2）试剂 HBsAg酶联免疫试剂盒购自深圳华康生物医学工程有限公司。
       （3）仪器 瑞士TECAN公司RSP 100全自动加样仪；德国DADE BEHRING 公司BEP III 全自动酶标仪。
2 方法
       温度和洗板方式 准备8 块微孔板，所有加样由RSP 100全自动加样仪完成，每板阴性血清、低值血清和高值血清交叉加样各24孔，按标准操作规程进行ELISA操作，测定波长450nm，参考波长650nm。
       ①将第一块微孔板移入BEP III 全自动酶标仪，检测步骤参照试剂说明书编程由仪器自动完成。
       ②将第二块和第三块微孔板置37℃水浴温箱温育1h，人分别以洗液定量和非定量方式手工洗板，分别测定吸光度值。
       ③将第四、五、六块板分别放置10℃、25℃、37℃温育1h，洗板和比色由BEP III 全自动酶标仪完成。
       ④将第七块和第八块微孔板分别置37℃干式温箱和37℃水浴式温箱温育1h，然后由BEP III 全自动酶标仪洗板。
3 统计学处理
       统计参数以均数± 标准差（x±s）、CV值表示，统计学处理采用t 检验。
结果
       1 全自动和手工洗板后测定的高值、阴性血清吸光度没有明显的差异（P>0.05）；低值血清吸光度有显著性差异（P<0.01）。手洗方式呈现个体差异，有时CV 值约高出全自动设备的1 倍（见表1）。

       2  三块微板分别放在三种不同的温度处理后，HBsAg高值可以检出，低值血清在10℃、25℃温育1h 洗板显色后测定全部漏检。只有温育在37℃ 的微板可检出低值阳性（见表2）。

       3 37℃干式温育和37℃水浴检测高值、低值血清HBsAg吸光度值没有显著差异（P>0.05，见表3）。

讨论
       1  ELISA是酶联免疫分析法中常用的分析方法。敏感度可达0.5ng/ml 水平，检测方法简单，因而被中小医院广泛使用。但是如果不注意正确的操作规程，将影响结果的准确性。在各个实验室环境不同的情况下，如果对实验各环节进行标准化，排除潜在的影响因素，可以最大限度地降低检测的系统误差。全自动酶免分析仪设备克服了手工操作的局限性，避免了人为因素带来的偶然误差，使检测结果的精密度、重复性、灵敏度、特异性有所提高［2］。
       2 洗板对检测的影响 洗板是实验成功的关键，洗板不彻底，将使非特异性呈色增高，洗板过度将出现低值阳性的样本漏报。洗涤液要定量加样，以免造成孔间污染，出现错误结果。本实验研究发现，我们以2 位熟练技术员手工洗板检测，但检测结果不一致，有的手工洗板方式的批内变异仍明显高于自动化检测方式，说明采用手工检测的实验室应自行探索本实验室的最佳检测条件，如浸泡时间、拍板程度等都有要有规范，单凭熟练程度是难以保证ELISA 重复性的。
       3  本研究结果表明微孔板的温育方式对测定结果影响不大，37℃干式温育和水浴温育无差异。而温育温度影响较大，尤其是低值检测结果有显著性不同，温度低时导致吸光度减低，出现低值阳性的样本漏报而发生错误结果，因此必须实施对于ELISA 温育设备的温度监控尤其在基层医院或现场试验时要引起重视。

参考文献

［1］吴键民. 临床化学全自动免疫分析［M］. 北京：科学出版社，2000. 33 - 69.
［2］李玉笑，郑优荣，肖绍英，等. FAME 酶标分析在安全输血中的应用［M］. 广东医学，2002，5：461 - 463.

                                                                                                                编辑：范伟伟