相关肿瘤标志物在膀胱癌诊断和治疗监测中的应用研究进展

小林

       李胜华，男，1984年北京市卫生干部进修学院，相当于医学基础本科。1996年获第二军医大学医学硕士；1998年获得美国NIH博士后研究基金（Postdoctoral Associate Fellowship Award），遂进入美国Iowa大学药理系，师从Dr. Mario Ascoli 教授，进行HCG/LHR信号传导研究，负责完成了HCG/LHR胞膜外部分的结构对其信号传递的影响的研究课题和运用酵母双杂交技术，发现了一种新的与生殖受体信号传递有关的基因（p38JAB1），并对其蛋白结构以及对生殖受体信号传递影响进行了研究。以第一作者发表2篇文章于JBC杂志。2000年，进入Michigan大学生物系，负责胰岛素样生长因子受体的信号传递及其结合蛋白在细胞内转运的研究课题。2001年作为Research Associate进入加拿大Guleph大学，与加拿大国家科学院生物所（NRC-IBS）Dr Roger Mackenzie教授合作进行大肠杆菌O157纳米抗体课题研究，2003年遂进入NRC-IBS作为纳米抗体研究室技术总监（终生职位）。2010年底回国，获天津市国际生物医药联合研究院特聘教授和天津科技大学特聘教授，硕士研究生导师。

一、膀胱癌简介
       膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，治疗后复发率很高，严重威胁着人类健康。在国际上，膀胱癌患者的死亡率位于癌症患者死亡的前十位，膀胱癌发病率位列男性最常见实体瘤的第六位，女性位列第十位；在我国，男性膀胱癌发病率位列最常见恶性肿瘤的第八位，女性则排在第十二位以后。男性膀胱癌发病率约为女性的3-4倍。美国2010年报道，年新发膀胱癌病例70530例，年死亡14680例。我国年新发膀胱癌病例超过10万例。膀胱癌可发生在任何年龄，其多发年龄段为51～70岁，发病高峰为65岁左右，罕见于30岁以前。发病时80%～85%左右病人肿瘤局限于膀胱，15%～20%有区域淋巴结转移或远处转移。

（一）疾病分类
       从广义上讲，膀胱癌可分为两种类型，即原发癌和转移癌。原发性膀胱癌起源于膀胱本身，转移癌来源于其它器官恶性肿瘤，只是癌细胞扩散到了膀胱，一般通过血流、淋巴系统或者直接从邻近器官侵袭到膀胱，如前列腺、直肠、子宫颈等。原发性膀胱癌要比转移性膀胱癌常见得多。膀胱癌的形态有多种：
       1）乳头状，外形看上去有的像花菜，有的像水草，有一个细蒂与膀胱壁相连；
       2）扁平状，外形看上去呈片状或条状，天鹅绒样，表面发红，没有蒂与膀胱壁相连；
       3）实体状，外形看上去像疣样赘生物，块状，基地广，有一个宽蒂与膀胱壁相连。
       膀胱癌中最常见的是尿路上皮癌，占90%以上，其中大约70%的尿路上皮癌是乳头状的，它比广基和无蒂的肿瘤有更好的预后。比较少见的膀胱癌有鳞状细胞癌、腺癌和脐尿管癌等。鳞状细胞癌大约占膀胱癌的3%-7%，不像尿路上皮癌那样淋巴结转移比较多，但是容易直接扩散，穿透膀胱到达邻近器官。鳞状细胞癌局部侵犯比较严重，而且对放化疗不敏感，因此比尿路上皮癌预后差。膀胱腺癌非常少见，大约占所有膀胱癌的2%，具有高度的侵袭性，预后更差。脐尿管癌是膀胱腺癌的一种特殊类型，由于来源与膀胱尿路上皮不同，起源于膀胱外层，并向膀胱内层侵犯。它可以转移到淋巴结、肝脏、肺和骨骼等脏器。

（二）临床分期
       目前，膀胱癌的分级广泛采用WHO的国际肿瘤组织学分类（WHO1973，1998，2004）分级标准，而浸润深度则主要以国际抗癌联盟（International Union Against Cancer，UICC） TNM分期法为标准。
1、膀胱癌的组织学分级
       膀胱癌的分级与膀胱癌的复发和侵袭行为密切相关。膀胱肿瘤的恶性程度以分级（Grade）表示。关于膀胱癌的分级，目前普遍采用WHO分级法（WHO 1973，WHO/ISUP 1998，WHO2004）。
       1）WHO1973分级法 1973年的膀胱癌组织学分级法根据癌细胞的分化程度分为高分化、中分化和低分化3级，分别用grade 1、2、3或grade Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示 （表1）。
       2 ） WHO / ISUP 分级法： 1998 年WHO 和国际泌尿病理协会（International Society of Urological Pathology，ISUP） 提出了非浸润性尿路上皮（移行细胞）癌新分类法，2004年WHO正式公布了这一新的分级法。此分级法将尿路上皮肿瘤分为低度恶性倾向尿路上皮乳头状肿瘤（papillary urothelial neoplasms of low malignant potential，PUNLMP）、低分级和高分级尿路上皮癌（表1）。低度恶性倾向尿路上皮乳头状肿瘤的定义为尿路上皮乳头状肿瘤，其细胞形态正常，无恶性肿瘤的细胞学特征。虽然，此种尿路上皮肿瘤进展的风险很小，但不完全属于良性病变，仍有复发的可能。

2、膀胱癌的分期
       膀胱癌的分期指肿瘤浸润深度及转移情况，是判断膀胱肿瘤预后的最有价值的参数。国际抗癌协会的2002年第6版TNM分期法已被普遍采用，2009年更新为第7版，其中膀胱癌的T分期和M分期较过去的2002年第6版没有变化，N-淋巴结分期进行了重新修订，不再以淋巴结大小作为淋巴结分期的依据。
       膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌（Tis, Ta, T1）和肌层浸润性膀胱癌（T2以上）。原位癌虽然也属于非肌层浸润性膀胱癌，但一般分化差，属于高度恶性的肿瘤，向肌层浸润性进展的几率要高得多。
       1）T（原发肿瘤）分期为：Tx期—原发肿瘤无法评估；T0期—无原发肿瘤证据；Ta期—非浸润性乳头状癌；Tis期—原位癌；T1期—肿瘤侵及上皮下结缔组织；T2期—肿瘤侵犯肌层，还可细分为T2a期—肿瘤侵犯浅肌层（内侧半）和T2b期—肿瘤侵犯深肌层（外侧半）；T3期—肿瘤侵犯膀胱周围组织，还可细分为T3a期—显微镜下发现肿瘤侵犯膀胱周围组织和T3b期—肉眼可见肿瘤侵犯膀胱周围组织（膀胱外肿块）；T4期—肿瘤侵犯以下任一器官或组织，如前列腺、子宫、阴道、盆壁和腹壁，还可细分为T4a期—肿瘤侵犯前列腺、子宫或阴道和T4b期—肿瘤侵犯盆壁或腹壁。

       2）N（区域淋巴结）分期为：Nx期—区域淋巴结无法评估；N0期—无区域淋巴结转移；N1期—真骨盆区（髂内、闭孔、髂外，或骶前）单个淋巴结转移；N2期—真骨盆区（髂内、闭孔、髂外，或骶前）多个淋巴结转移；N3期—髂总淋巴结转移。
       3）M（远处转移）分期为：Mx期—远处转移无法评估；M0期—无远处转移；M1期—远处转移。
（三）与疾病有关的风险因子
       膀胱癌的发生是复杂、多因素、多步骤的病理变化过程，既有内在的遗传因素，又有外在的环境因素。经流行病学等多方面的研究，与膀胱癌发病有较明显相关性的风险因素和一些潜在的风险因子如下：
       1、长期接触芳香族类的工种，如染料、皮革、橡胶、油漆等，铝铁钢生产等，长期接触柴油机废气等，可出现较高的膀胱肿瘤发生率，是较明确的致病风险因素。
       2、吸烟也是最为肯定的一种增加膀胱肿瘤发生率的危险因素，约30%-50%的膀胱癌由吸烟引起，吸烟可使膀胱癌危险率增加2-4倍，其危险率与吸烟强度和时间成正比。
       3、膀胱粘膜局部长期遭受刺激，如长期慢性的感染、膀胱结石的慢性刺激、尿道肿瘤治疗等均可诱发膀胱肿瘤。
       4、某些药物、寄生虫病等亦可诱发膀胱癌。
       5、与遗传、基因和环境因素等有关。如有家族史者发生膀胱癌的危险性明显增加，遗传性视网膜母细胞瘤患者的膀胱癌发生率也明显升高。对膀胱癌病因学中的基因改变研究显示，原癌基因突变后变为癌基因，可使细胞无节制的分裂，导致膀胱癌复发和进展。与膀胱癌相关的癌基因包括HER-2、H-Ras、BcL-2、FGFR3、C-myc、c-erbB-2、MDM2、CDC91L1等。膀胱癌发生的另一个重要分子机制是编码调节细胞生长、DNA修复或凋亡的蛋白抑癌基因失活，使DNA受损的细胞不发生凋亡，导致细胞生长失控。研究发现：含有p53、Rb、p21等抑癌基因的17、13、9号染色体的缺失或杂合性丢失与膀胱癌的发生发展密切相关，而且，P53、Rb的突变或失活也与膀胱癌侵袭力及预后密切相关。近来，SYK、CAGE-1等基因的超甲基化被认为与膀胱癌的进展相关。此外，膀胱癌的发生还包括编码生长因子或其受体的正常基因的扩增或过表达，如EGFR过表达可增加膀胱癌的侵袭力及转移。

二、临床诊断及用于辅助诊断的肿瘤标志物检测

（一）临床诊断检测应用的金标准
1、尿细胞学检查（Urinary cytology）
       尿细胞学检查是已建立的无创性检测泌尿系标志物的标准方法，是膀胱癌诊断和术后随诊的主要方法之一。尿标本的采集一般是通过自然排尿，也可以通过膀胱冲洗，这样能得到更多的癌细胞，利于提高诊断率。尿细胞学阳性意味着泌尿道的任何部分，包括：肾盏、肾盂、输尿管、膀胱和尿道，存在尿路上皮癌的可能。根据文献报道，尿细胞学检测膀胱癌的敏感性为13%～75%，特异性为85%～100%。敏感性与癌细胞恶性分级密切相关，分级高的膀胱癌或原位癌，敏感性和特异性均较高，而分级低的膀胱癌敏感性较低，一方面是由于肿瘤细胞分化较好，其特征与正常细胞相似，不易鉴别，另一方面由于癌细胞之间黏结相对紧密，没有足够多的癌细胞脱落到尿中而被检测到，所以尿细胞学阴性并不能排除低级别尿路上皮癌的存在。尿标本中癌细胞数量少、细胞的不典型或退行性变、泌尿系感染、结石、膀胱灌注治疗和检查者的技术差异等因素会影响尿细胞学检查结果。
2、膀胱镜检查和活检（Cystoscopy，biopsy）
       膀胱镜检查是目前诊断膀胱癌最可靠的方法，是膀胱癌诊断和术后随诊的主要方法之一。通过膀胱镜检查可以明确膀胱肿瘤的数目、大小、形态（乳头状的或广基的）、部位以及周围膀胱粘膜的异常情况，同时可以对肿瘤和可疑病变进行选择性活检以明确病理诊断。膀胱癌通常为多灶性，其原位癌可表现为类似炎症、发育不良等病变，也可表现为正常。当尿脱落细胞学检查阳性或膀胱粘膜表现异常时，进行选择性活检，以明确诊断和了解肿瘤范围。当尿细胞学检查阳性而膀胱粘膜表现为正常、怀疑有原位癌存在时，进行随机活检。如果膀胱肿瘤为原位癌、多发性癌或者肿瘤位于膀胱三角区或颈部时，并发前列腺部尿道癌的危险性增加，可进行前列腺部尿道活检，此外，尿细胞学阳性或前列腺部尿道粘膜表现异常时，也应进行该部位的活检。其局限性是对于非肌层浸润性膀胱癌，特别是对于那些低风险的膀胱癌的正常膀胱粘膜实行常规的随机活检或选择性活检，检出率极低（小于2%），多中心研究评价报道其假阴性率达37%。
3、荧光膀胱镜检查（Fluorescence cystoscopy，FC）
       近年来研究发展的荧光膀胱镜检查是通过向膀胱内灌注光敏剂，如：5-氨基酮戊酸（5-ALA）、Hexaminolaevulinate（HAL）或Hypericin，产生的荧光物质能高选择的积累在新生的膀胱粘膜组织中，在激光激发下病灶部位显示为红色荧光，与正常膀胱粘膜的蓝色荧光形成鲜明对比，能够发现普通膀胱镜难以发现的小肿瘤、发育不良或原位癌，检出率可以提高14%～25%。欧洲泌尿外科学会指南推荐，在怀疑有膀胱原位癌或尿细胞学检查阳性而普通膀胱镜检查正常时，应该考虑使用荧光膀胱镜做进一步检查。有报道在荧光膀胱镜引导下进行膀胱肿瘤电切术，与普通的电切术相比，能够明显降低肿瘤的术后复发率，但对肿瘤的进展率和患者生存率的影响还有待于做进一步的临床观察。荧光膀胱镜的缺点是诊断膀胱癌的特异性相对不高，炎症、近期膀胱肿瘤电切术和膀胱灌注治疗会导致假阳性结果。

（二）已用于临床辅助诊断的相关尿液肿瘤标志物
       由于尿细胞学检查的检出率低，且不能区分膀胱与肾盏、肾盂、输尿管、尿道这些部位也有发生尿路上皮癌的可能性；而膀胱镜检查和活检是有创性检查，且对早期、膀胱粘膜正常、非肌层浸润性膀胱癌检出率极低，因而研究敏感性好、特异性高的检测相关尿液肿瘤标志物的无创性膀胱癌诊断试剂非常必要。近十多年来已有多个尿液肿瘤标志物检测试剂盒在美欧已获认证批准并用于临床对膀胱癌进行辅助诊断，现分述如下：
1、膀胱肿瘤抗原（Bladder tumor antigen，BTA）
       BTA是一个类似于人补体因子H的人补体因子H相关蛋白（human complement factor H–related protein，hcfHrP），能与补体因子3Cb相互作用，干扰补体激活通道中瀑布式酶助级联反应，潜在地选择性地有利于肿瘤细胞生长。BTA是膀胱肿瘤生长过程中释放进入膀胱的膀胱肿瘤相关抗原，随尿液排出，可作为膀胱癌抗原检测出来。最初检测BTA的方法是一种乳胶凝集试验，定性测定试剂盒，现已退出市场。现在市场上有2种类型试剂盒，即BTA-stat和BTA-TRAK为BTA测定的改进方法，是通过BTA特异性单克隆抗体，提高了检测的灵敏度和特异性。BTA-stat是一种免疫层析，定性测定，POCT（point-of-care test）试剂盒，FDA批准用于膀胱癌的监测，而不能用于疾病的筛查和诊断；BTA-TRAK是定量酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒。BTA-stat和BTA-TRAK对膀胱癌诊断的敏感性和特异性分别为50-70%和67-78%。血尿和良性泌尿生殖疾病易造成BTA-stat/TRAK检测的部分假阳性结果，从而使这种检测方法的特异性降低到46%。有研究发现，若患者正在接受丝裂霉素（mitomycin）C灌注和既往卡介苗(bacillus calmetteguerin，BCG)治疗对BTA-stat/TRAG的检测有很大影响，因此，建议进行BTA-stat/TRAG检测时应先排除这些因素。用BTA-stat/TRAG检测膀胱癌是否复发时，比尿细胞学检查有更高的敏感性（75%vs25%），因此，BTA-stat/TRAG可用于膀胱癌的复发监测和预后评估。
2、核基质蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22）
       核基质蛋白（NMPS）是细胞核结构框架的重要组成部分，在DNA复制、转录和基因表达调控方面扮演重要角色。NMPS在乳腺、结肠、骨骼和尿路上皮中均发现了肿瘤特异性NMP。其中NMP22是特殊的核有丝分裂器蛋白与单倍染色体在子代细胞中合适分布相关，NMP22是尿路上皮特异性肿瘤相关标志物，在移行性膀胱癌（bladder transitional carcinoma，BTCC）中NMP22因肿瘤细胞凋亡由细胞核释放进入尿中。用ELISA定量测定尿液中NMP22碎片的活性单位，可检测出肿瘤的存在。研究显示膀胱癌细胞系的NMP22浓度比正常膀胱尿路上皮细胞NMP22的浓度高要25倍；膀胱癌活动期病人的NMP22浓度比正常人的平均水平要高5倍。前列腺癌和肾癌时尿液中NMP22水平亦可升高，但远低于膀胱癌，但在尿路结石、良性前列腺增生（benign prostate hyperplasia，BPH）、脓尿、血尿和其他良性尿路病变中NMP22的阳性率亦较高。在排除这些疾病后。NMP22的特异性可提高，接近于尿细胞学检查。因此，进行NMP22检测时应先排除良性疾患的可能。尿液中NMP22诊断膀胱癌比脱落细胞检查有更高的敏感性，尤其在Ta期和高分化肿瘤的诊断时。国外市场有POCT定性和ELISA定量测定NMP22试剂盒，在对28个研究中，总共测定10119例膀胱癌患者尿液的NMP22浓度数据进行分析，得到该类试剂盒的灵敏度为68%（95% CI, 62–74%），特异性为 79%（95% CI,74–84%）。目前认为，NMP22可以作为诊断膀胱癌和监测膀胱癌复发的一个非侵人性辅助方法，指导泌尿科医生确定BTCC患者是否需要膀胱镜检查。
3、荧光探针原位杂交（Florescence in situ hybridization，FISH）
       FISH是通过用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸，再借助荧光显微镜，在细胞和（或）组织中观察并分析细胞内杂交于靶序列的多种彩色探针信号，以获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息的一项新技术。FISH是近年来发展较快的一种用于检测膀胱癌的基因分子测定方法，由于尿路上皮肿瘤多个染色体如1，3，4，7，8，9，11，17会发生改变，应用FDA批准的UroVysion?（Vysis, Downers Grove, IL）一个多靶点测定试剂盒，可检测染色体3、7、17的非整倍性以及9p21在癌细胞基因位点的缺失，见图4。在与尿细胞检查法进行比较检测研究结果显示，尿细胞检查法的敏感性为48%，FISF法为74%；在对膀胱癌不同分级的比较测试研究结果显示：当膀胱癌分级为1、2、3，分期Ta、T1时，尿细胞检查法的敏感性分别为19%、50%、71%、35%、66%，而FISH法的敏感性分别为58%、77%、96%、64%、83%。以后多种后续研究表明FISH的敏感性为69%～85%，特异性为78%～92%。FISH与尿细胞学相结合，检测膀胱癌的敏感性可显著提高到97.4%，而NMP22与尿细胞学相结合检测的敏感性可达92.1%。FISH技术作为诊断和监测膀胱癌的一个简单、无创性诊断方法，具有较高的灵敏性和特异性，其对提高患者膀胱癌的早期诊断率具有重要临床应用价值。然而FISH虽然已经应用于临床，但是其检测费用较高，在国内临床中普遍开展尚需一段时间。另外，目前利用FISH技术进行肿瘤的诊断时，通过荧光显微镜观察，需要一定经验，尚缺乏统一的阳性判断标准。今后，尚需对大样本量的正常人群、膀胱癌患者及非膀胱癌泌尿系疾病患者的尿脱落细胞做深入的研究，以制定适当的阳性标准，以便为膀胱癌的临床诊断和治疗提供准确的依据。

4、纤维蛋白原/纤维蛋白降解产物（fibrin/fibrindegradation product，FB/FDP）
       FB/FDP 是纤维蛋白溶酶原与纤维蛋白和纤维蛋白原发生作用产生的蛋白片段。膀胱肿瘤细胞产生的血管内皮生长因子(VEGF)，可增加外周微血管的通透性，导致血浆蛋白、纤维蛋白原及各种凝血因子的漏出增加，使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，后者经纤维蛋白溶酶进一步降解变成FDP，因此，通过检测FDP可有助于膀胱癌的诊断。高分级肿瘤更易致FDP的漏出，因此对高分级肿瘤具有更好的预测价值。可用于膀胱切除、膀胱替代术后患者的检测，以了解肿瘤是否复发。FDP的检测试剂为POCT定性检测试剂盒，由于其产品的稳定性不够好，现已停止了市场销售。
5、免疫荧光检测法（ImmunoCyt）
       ImmunoCyt是一种尿细胞学和免疫荧光相结合的直接免疫荧光细胞染色检测方法，用于检测膀胱癌尿路上皮脱落尿液中肿瘤细胞标志物。试剂盒里有3种荧光标记单克隆抗体的混合物，其一是抗CEA（carcinoembryonic antigen）抗体，另外二种是抗膀胱癌相关的黏液素（Mucins）蛋白的抗体。该试剂盒的敏感性为50~100%，特异性为69~79%。当用于膀胱癌分级为1、2、3病例的检测时，其敏感性分别为79.3%，84.1%，92.1%。经8个独立研究，进行了2896个病例检测的系统分析结果，其敏感性为84%（95%CI，77-91%），特异性为75%（95%CI，78-92）。但有研究报道大约有50%的良性前列腺增生和40%的膀胱炎症病例会出现ImmunoCyt假阳性检查结果，因而ImmunoCyt仅用于膀胱癌病后的监测。
       尽管上述这些试剂盒和检测方法已用于临床对膀胱癌病例尿液样品检测多年，但因其敏感性、特异性、或检测费用高、或技术操作要求严格等原因，目前还只能用于对膀胱癌的辅助诊断，结合细胞学检测方法，用于膀胱癌后的监测，以减少或部分替代膀胱镜检和活检。

三、相关膀胱肿瘤标志物应用研究进展

       理想的早期诊断和监测膀胱癌的方法应该是客观的、非侵入性的、具有高敏感性和特异性，且操作简便，费用低廉。到目前为止，还没有任何膀胱癌单一肿瘤标志物检测试剂盒能达到这一要求，近年来随着生物医学科学技术的发展，多项新的膀胱肿瘤相关标志物和基因检测研究已取得较大的进展，现简述如下：
1、细胞角蛋白（cytokeratin，CK）
       细胞角蛋白是上皮细胞中间丝的组成成分，研究发现，某些种类CK与膀胱癌有关。CK20、CK19、CK8和CK18等在膀胱癌中的诊断作用受到研究者的广泛关注，其中检测CK19的可溶性片段-CYFR21-1这种方法对膀胱癌早期诊断具有更高的应用价值。有报道CYFR21-1对G1级膀胱癌的敏感性是尿细胞学检查的3倍，在检测膀胱癌复发时，被尿细胞学漏检的复发患者中有65％能用CYFR21—1检出，但尿道结石、尿道感染和既往卡介苗治疗也会导致阳性结果。Marta等对CYFRA21、NMP22等检测进行了比较，在确定特异性为95％时，CYFR21-1的敏感性最高，同时实验结果还表明，CYFR21-1对G1级、低分期膀胱癌有较高的敏感性。
       IDL Biotech （Bromma, Sweden）公司开发了UBC品牌的POCT定性和ELISA定量检测CK8、CK18的试剂盒，对于180例膀胱癌病人的尿液进行检测，其敏感性为66%，特异性为90%。该试剂盒还需要在多个检测中心进行试验评价。
       目前研究对CK20在膀胱癌诊断中的作用颇有异议。最初用RT—PCR法检测膀胱癌病人尿液中CK20进行检测，发现CK20对膀胱癌诊断有较高的敏感性和特异性。后来发现在长期膀胱炎、尿道感染、非典型增生等非癌病变中也有CK20的表达。近来，Retz等发现，CK20在尿路结石、尿道感染等病人和健康人尿液中亦有较高的表达，故认为CK20对膀胱癌诊断价值需要重新考虑。
2、核转录因子：BLCA1、BLCA4
       BLCA1-6是新近发现的一组膀胱肿瘤相关NMP。其中BLCA1、BLCA4存在于膀胱恶性肿瘤的部位。初步的研究结果显示，用ELISA方法检测膀胱癌患者尿液中的BLCA4，其敏感性为89-96%，特异性为100%，并且与分级分期无关。BLCA4与膀胱炎和尿路感染没有直接联系，但与脊髓损伤可能有一定联系。BLCA4比NMP22有更高的准确性和特异性，因为它不存在于其他类型的肿瘤或组织中。因此，BLCA4可以作为膀胱癌特异性尿标志物进行筛查。一个用BLCA4作为早期膀胱癌诊断标志物的前瞻性临床试验正在进行中。
3、透明质酸与透明质酸酶（Hyaluronic acid and Hyaluronidase,HA-HAase）
       HA是一种细胞外黏多糖，具有支持肿瘤细胞粘附和迁移，保护肿瘤组织逃避免疫监视的作用。膀胱癌患者尿液中透明质酸片段的分子量大小随肿瘤分级的变化而变化，透明质酸片段越小，肿瘤分级越高。HAase是一种内源性糖苷酶，由膀胱癌细胞分泌，能降解HA成为小片段，促进血管形成，与膀胱癌侵润性有关。另一特殊的HAase—透明质酸黏多糖酶（HYAL-1），已证明作为一种肿瘤检测的标志物，能预测肿瘤的生长、侵入性、肿瘤血管新生成性。在有高活性HAase的膀胱癌患者尿液HYAL-1的mRNA水平比正常膀胱细胞和组织的mRNA水平高10-30倍，因而HYAL-1也作为评估膀胱癌的一个潜在尿液肿瘤标志物。不管膀胱肿瘤级别高低，平均HA水平都增高3～7倍，而HAase仅在较高级别膀胱癌才增高5～8倍。HA试验对各级别膀胱肿瘤的敏感性相似。提示其为检测低级别膀胱癌的一个可靠的非侵入性方法，HAase试验则更多表明肿瘤为中度或高度恶性。HA对G1 级膀胱癌较敏感，而HAase对G2、G3 级肿瘤更敏感。单独HA试验和HAase试验敏感性及特异性均在84%～92%。二者联合试验敏感性更高，且对各期膀胱癌有相同的敏感性。用HA- HAase 监测膀胱癌复发的研究显示，有40%～60%的阳性检出病例在3～6个月后复发，因此，有膀胱癌病史的患者HA-HAase试验阳性可能是病情将复发的一个征兆。HA-HAase在健康人群中有5%的阳性检出率，前列腺癌、BPH、泌尿系结石及感染等疾病中阳性检出率为15-20%。这项实验的不足之处在于：(1)尿中HAase水平很高的患者的HA容易裂解成更小的碎片，用ELISA法便不能再检测出HA，出现假阴性结果。(2)对诊断低分级肿瘤的敏感性较差，甚至低于尿细胞学检查。
4、Lewis X （LeX）抗原
       Lewis相关抗原是血型抗原系统的细胞表面分子，可分为4个亚类（LeA、LeB、LeY、LeX）。LeX在正常尿路上皮中不表达，但可在膀胱移行细胞癌中表达，且与肿瘤的分期、分级无关。目前，LeX 抗原是唯一具有潜在诊断价值的抗原。应用LeX的单克隆抗体测定脱落尿路上皮细胞的LeX抗原，采用细胞免疫学方法对260例患者单份尿液进行检测，其敏感性为79.8%（95%CI，70.1-87.4%）, 特异性为86.4%（95%CI，80.6-90.9%）。对89例患者收集连续2份尿液样品进行测试，其敏感性增加到95.1%（95%CI，84.8-99.2%）。这一标志物还行进一步进行大样本，多中心试验检测其特异性和敏感性，评价其能否作为膀胱癌诊断用标志物。
5、生存素（survivin）
       Survivin是一种抗凋亡蛋白，在肿瘤的发生发展中起重要作用，其mRNA在胚胎和胎儿期可选择性表达，在正常成人组织中表达量在不可测或较低水平，而在肿瘤组织中则高表达。Survivin是一个具有潜在价值的肿瘤标志物，与肿瘤预后也密切相关。Swana等研究发现膀胱癌中Survivin蛋白的表达与肿瘤复发有关，I级膀胱癌Survivin蛋白阴性表达者的复发时间为36±16个月，而Survivin蛋白阳性表达者的复发时间为12±6个月，两者差异有显著意义(P<0.001)。 用Western-blot和RT-PCR检测了158例患者，在新生或复发性膀胱癌患者中生存素及其基因表达的阳性率为100%，在泌尿系良性疾病中的阳性率为13.3%，在泌尿生殖系其他肿瘤和健康志愿者中的阳性率为0%。这些研究表明，Survivin对新生或复发膀胱癌的诊断具有较高的敏感性和特异性。在膀胱癌大样本试验研究中显示，高水平的Survivin与膀胱癌发生风险和膀胱癌更高的级别有关，而与膀胱癌的侵袭性无关。在这个研究中，Surivivin的敏感性为64%，特异性为93%。通过与尿细胞学、尿NMP22检测和患者年龄进行对比分析，尿Surivivin的水平与膀胱高级别尿路上皮癌有独立的相关性，其诊断的稳定性需更大的样本来验证。
6、可溶性Fas蛋白（Soluble Fas）
       在各种生理过程中，如在眼、睾丸、大脑和母-胎界面的免疫稳定性的维持以及细胞毒T细胞和自然杀伤细胞介导肿瘤细胞死亡的Fas信号通路中，Fas是主要的凋亡介质。用ELISA检测膀胱癌患者尿液中的sFas，在膀胱癌进展期和复发患者中，sFas水平较高。在与NMP22进行比较检测试验结果显示，2种标志物的敏感性约为75%，没有显著差别，而sFas的特异性为75.7%（95%CI，69.2-81.9%）要高于NMP22为70.4%（95%CI，63.7-77.2%）。sFas在作为膀胱癌尿液肿瘤标志物之前，其测定方法还需要标准化，还需要进行大样本临床样品检测试验。
7、端粒酶（telomerase，TLMA）
       TLMA是一种核糖蛋白体酶，由3种亚单位：即RNA组份（hTR）、端粒酶相关蛋白（TP1）和端粒酶反转录酶（hTERT）组成。已用多种方法对TLMA作为肿瘤标志物进行了评价。各级膀胱癌上皮细胞瘤患者尿中均有端粒酶活性表现。端粒酶活性测定的标准方法是端粒酶重复扩增程序法（TRAP测定法），另一测定方法是用PCR方法测定端粒酶亚单位的催化活性（hTERT PCR）。经多项研究评价了TRAP法测定端粒酶活性结果的可信度，对218膀胱癌患者尿液进行TRAP法测定，其敏感性为90%（95%CI，83-94%），特异性为88%（95%CI，79-93%）。当用hTERT PCR测定，其敏感性为84-95%，特异性为65-94%。这2种检测方法在检测低级别的膀胱癌时，其敏感性要明显优于尿细胞学方法, 可用于膀胱癌的早期诊断。端粒酶可作为一个潜在有用的尿液肿瘤标志物。但其检测方法需要训练有素的人员，并要进行标准化和大规模临床实践研究。
8、微卫星分析（Microsatellite Analysis）
       微卫星是指在整个人基因组里存在高度多形性DNA（1-4个碱基对）的重复。这些微卫星的突变，导致基因组失去异质性和/或微卫星的不稳定性，可作为监测肿瘤发生的标志物。膀胱癌最为常见的基因变化是9号染色体丢失异质性。膀胱癌患者染色体4p，8p，9p，11p和17p也常常发生丢失异质性。对膀胱癌患者尿液中17-20微卫星标志物进行研究分析，其敏感性为72-97%，特异性为80-100%。染色体杂合子丢失（Loss of herozygosity，LOH）分析与尿细胞学进行双盲检测，结果显示LOH分析要显著优于尿细胞学检测法，特别是对于1和2级别的膀胱癌检测，LOH分析法敏感性分别为60%和51.8%，而细胞学方法敏感性分别为10%和18.5%。但两种方法结合进行检测，对1和2级别的膀胱癌，其敏感性可达72%，对于3级别的膀胱癌，可达96%。对于LOH和微卫星分析法进行独立研究结果显示，对于G1-G2的膀胱癌检测，其敏感性可达95%，对于Tis和Ta期膀胱癌，其敏感性可达100%。但该方法需要训练有素的人员和大样本临床实践做进一步评价。
9、蛋白质组学和基因组学（PROTEOMICS AND GENOMICS）
       蛋白质组学通过高通量地对比分析健康和疾病时蛋白质表达的改变，并通过对相应的蛋白质的功能进行研究，运用先进的高分辨2-D电泳、质谱分析、表面增强激光解吸/电离化等技术，或将肿瘤相关蛋白制成蛋白芯片检测其表达，对肿瘤进行分析。Vlahou等采用蛋白质组学技术研究了BTCC和泌尿生殖系统其他疾病及健康受试者的尿液样品，在BTCC患者中发现5个异常的新的蛋白质和7种异常的蛋白家族。应用这些蛋白质作为标志物诊断BTCC的总敏感性为87%，对低分级BTCC的敏感性为78%，而尿细胞学检查的敏感性仅为33%。这些结果支持用蛋白组学方法发展高敏感的尿膀胱癌诊断测试。
       基因组学是研究不同形式肿瘤的DNA或RNA序列和基因表达的显著变化。采用微阵列技术鸟枪法对多个DNA或RNA序列进行快速评价，以确证有膀胱癌潜在特征的序列。运用这些新技术已确证出Aurora激酶A做为膀胱癌标志物，用FISH法检测该标志物，其敏感性为96.6%，特异性为87%。已确证出的另一个尿路上皮肿瘤相关基因1标志物，其敏感性和特异性分别为80.9%和91.8%，对于高级别非侵入性膀胱癌的敏感性达91.1%。
10、DNA甲基化（DNA Methylation）和微小RNA（MicroRNA）研究
       DNA甲基化是肿瘤相关基因CpG岛的DNA甲基化，这些基因随后发生沉默，这些肿瘤相关基因可作为疾病活动的标志物。DNA甲基化有2种试验方法，即重亚硫酸盐焦硫酸测序和定量甲基化特异性实时PCR（qMSP）分析CpG甲基化。Chung，W等报道用DNA甲基化方法检测膀胱癌患者的尿沉渣，根据多基因预测模型，发现了6个甲基化标志物（MYO3A，CA10，SOX11，NKX6-2，PENK，and DBC1)，分析其中的（MYO3A，CA10，NKX6-2或DBC1或SOX11）4个标志物，得到敏感性为81%，特异性为97%，进一步分析，该方法对非肌肉侵润期膀胱癌（Ta，Tis和T1）的敏感性为81%，对于肌肉侵润期膀胱癌（T2，T3和T4）的敏感性为90%。Yu，Jian等研究报道用qMSP方法检测中国膀胱癌患者的尿沉渣，分析一组DNA甲基化标志物，为检查膀胱癌提供更敏感和特异性的方法。检测23例非肿瘤尿路损伤患者的尿沉渣样品，分析结果3例有4个基因DNA甲基化发生平率为6次。检测132例膀胱癌患者尿沉渣18个基因标志物，分析结果121例有11个基因DNA甲基化（SALL3，CFTR，ABCC6，HPR1，RASSF1A，MT1A，RUNX3，ITGA4，BCL2，ALX4，MYOD1，DRM，CDH13，BMP3B，CCNA1，RPRM，MINT1，BRCA1），敏感性为有91.7%，特异性为87%。其基因DNA甲基化与美国研究报道的基因不同。
       MicroRNAs （miRNA）是非编码RNA具有转录后调节基因表达功能。已在尿路上皮癌中观察到基因表达和功能的改变。MiRNA可能作为膀胱癌的潜在生物标志物和新颖的治疗靶点。
       近年来新的膀胱癌早期诊断生物标志物探索研究，DNA甲基化和MiRNA的研究是一个重要而高度热门领域，但要运用于临床还需更进一步的研究。
11、膀胱癌尿液中新的标志物
       膀胱癌尿液中新肿瘤标志物-突触蛋白已被我国肿瘤医学界发现，虽然发现该标志物在多种肿瘤患者血清中，其表达水平高于非肿瘤人群，但最新发现该标志物主要存在于膀胱癌患者的尿液中，经初步研究用ELISA定量测定200余例膀胱癌患者的尿液突触蛋白水平，膀胱癌患者的水平高于非膀胱癌人群100倍左右。膀胱癌术后复发病人比无膀胱癌复发人群高30倍以上。其检测敏感性为70%时，特异性为95%。术后复发的检测敏感性大于45%。将具有潜在的重要临床应用价值，由于我国目前还没有任何膀胱癌尿液诊断试剂盒，该膀胱癌标志物的发现，将为我国膀胱癌患者进行无创性诊断提供新的方法手段。填补国内在探索发现新的膀胱癌尿液标志物研究领域的空白，达到国际先进水平。

                                                                                            摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第四期
                                                                                                                   编辑：范伟伟