标准化癌症抗原检测的挑战和成功

孤独狼

       2012年AACC学术会议中，Memorial Sloan-Kettering Cancer Center的 Martin Fleisher博士发表题为《Challenges and Successes in Standardizing Cancer Antigen Assays》的演讲，以下是根据Martin Fleisher博士演讲内容进行整理的文章，希望为读者提供“标准化癌症抗原检测”相关内容。

       Fleisher博士曾提出两个问题：
       投票调查1：你希望你所在的实验室的所有肿瘤标志物检测被标准化成国际标准吗？
       投票调查2：你会接受非标准化到标准化检测的变化吗，这意味着临床数据将不一致而且新的参考范围和新的分割点（cut point）是必要的。你同意这样做吗？大家当然会同意。
       Fleisher博士解释道：如果你同意这样，你所有的数据库，所有病人的临床数据库，至今为止的检测数据库现在都会改变。在这种两难的情况下，如果我在我们的实验室做这种变化，在任何给定时间我们有652个临床协议（临床方案）在运行，而肿瘤标志物检测是每个协议的一部分，我会尽快跑出纽约，你都不能抓住我，因为每个协议都得变化，意味着我们必须向FDA报告每一个协议变化，和停止研究。所以，我们实际可做的就是改变必须改变的检测，因为有些10-15年前开始的检测不再可用，但是我们做的是一致化。
一、关于变化
       问题是，我们如何使其一致？如果Charles Darwin是对的（能够生存下来的物种不是最强的，也不是最聪明的，而是最适应变化的），那我们最好都要改变。如果Woodrow Wilson是对的（如果你想树立敌人，那就改变吧），我们就遇到问题了。所以在达尔文和威尔森之间，我们必须想到一个折中的办法。
       以下是我们实验室所做的肿瘤标志物（TM）的实际数据，我们从1987年开始保留这些统计数据（表1）。看最下面的数字，2012年，我们所做的肿瘤标志物一致升高，这里的赢家是CEA，48000多个检测/年；落后不远的是CA125，大约20000个检测/年，而CA15-3大约29000个检测/年。所以，想一下，如果我们必须改变这些检测，改变对48000个病人做CEA检测的方式或者说48000个病人结果，那意味着什么，我们又如何管理？这将成为我们遇到过的最令人困惑的情况。而我们在这种情况下，是因为我们测量的被测物的性质，我们在测量肿瘤标志物，不像葡萄糖或肌酐，我们可以倒出葡萄糖缓冲液，用比重法测量100mg，把它放在100ml水中，测量者一定会说结果是100mg/dl，那就是答案，一定会是100mg/dl。对CA15-3你就不能这么做，PSA也不能这样做。

二、肿瘤标志物标准化
       那我们怎么做呢？我们以3种方法为基础标准化肿瘤标志物。一种是对很多肿瘤标志物使用WHO或国家标准（WHO标准是什么稍后再谈）；如果可以的话，我们试图使用纯化材料；如果前面两种方法都不行，我们就采取一致化（harmonization） - 调整校准品使其符合参考标准。

       我们可以看到，在WHO肿瘤标志物标准中，AFP、降钙素、CEA、hCG、hCGβ亚组、PSA和游离PSA都标准化了，有WHO数值。你可以登录http://www.nibsc.ac.uk/products/directorylist.asp获得所有信息。所有这些肿瘤标志物都有标准品。你可以购买这些WHO标准品，然后在此基础上做检测。问题是，IVD厂商1、IVD厂商2都做检测，但是他们的检测是截然不同的。比如说，一个检测使用依据组织培养基制造的抗体，另一个IVD厂商使用依据WHO标准品制造的抗体。这是两种不同的抗体，我保证你在做这个检测时会获得两个不同的数值。
       我们有务必检测的所有肿瘤标志物，我们在实验室检测它们。红色标记（表2）的经过FDA批准，蓝色标记的未经过FDA批准，也很难获得FDA批准。但是我们在许多方面使用，因为我们确认了这些检测，经过完整的确认过程，提交了数据。就我们的例子而言，我们把数据提交给纽约州。纽约州医院的CLIA监管机构-纽约州卫生局接受了确认，批准你在实验室运行检测。不仅批准你可以运行检测，你还可以收费，把数据放在图表中。你唯一需要做的事，就是做一个声明，指出这个检测不是FDA批准的，但是确认数据保存在实验室。我们不是对协议病人做这些检测的，而是任何病人。但是我可以告诉你，如果我在我的实验室做CEA检测，我的一位好同事-儿童医院的，在他的实验室做这个检测，我们会获得2个不同的数字，完全不同的数字。实际上，我们的数字可能表明病人有严重的临床问题，他的数字可能表明病人没有临床问题。我们必须使其一致。所以，我们做的另一件事是也把这个放在图表中。我们的电子病历/图表中的数据不能用对病人使用的其他方法证明，因为如果病人到街对面的纽约医院，在他们的仪器上做检测，猜一下结果，只是50-英尺的距离，他们的图表是一回事，我们的图表是另外一回事。所以我们必须在图表中明确指出，你知道这是CLIA监管问题，你必须具体说明分析程序是如何进行的，你不能只是说由分析仪检测完成，而必须具体指出用的哪个仪器。如果使用贝克曼系统，请说明；如果使用雅培系统，也要说明；如果使用西门子，必须说明使用了哪个系统。因为这是我们的现状，我们没有一致化，不在一个水平上。但是，我们接近了。

WHO或国际标准
优势
- 一致的一级参考物质来源
- 抗原是明确和特有的
- 制造商之间通常有广泛共识
- 大多数制造商可以获得
- 与新一代产品一致
劣势
- 基质效应-检测可能识别出在不同于人类血清的缓冲液/蛋白质中制备的标准品。
- 标准品可能不是线性稀释。

- 一级标准品的长期稳定性可能是个问题。
- 抗原决定部位变异性–由于分裂，结合蛋白，位阻效应和后合成过程导致的变异。
- 依据一级标准品制造的二级标准品可能使用不同来源的材料。
- 肿瘤产生的抗原的分子结构可能不同于标准品。

三、抗体界定的肿瘤标志物
       我们有抗体界定的肿瘤标志物。所有这些肿瘤标志物（CA 125，CA19-9、CA 50、CA 549、CA 15-3、CA72-4、CA 27.29）都不是由抗原界定的，它们是由抗体界定的。所以我们有一个基于CA125的检测是标志抗体的。我们有基于抗体的检测，而不是基于抗原的。
※标准化取决于抗原的生物化学属性，抗体的抗原决定部位和检测格式。
※组织培养粘蛋白核心蛋白与肿瘤产生的蛋白相似，除了串联重复序列，但是良性和肿瘤抗原之间的糖基化是高度变化的。
       基于抗体的检测有些优势。抗体特异性在制造商之间应该是相同的。理想上，当使用相同的抗体时，试验应该检测相同的成分。在实际做法中，特异性通常由于抗原和抗体的复杂性而发生巨大变化。只要我们知道这点，我们就知道如何处理检测。我们用于一级和二级标准品的材料是不同的。相同的材料可用于一级和二级标准品。如果抗体相同，制造商之间的标准化是一致的，但是抗体不同。
       劣势也有很多：无行业标准化。标准化依据的真实参考检测（reference assays）很少见。安置和保存一级校准品极其复杂：参考检测比较（如果有的话）是大致印象；难以防止检测漂移和偏移；抗原决定部位通常出现在截然不同的主链（backbones）上。抗原可以从截然不同的来源获得：很多细胞株在截然不同的分子主链上表达抗原决定部位，导致抗体识别和表观浓度有很大差异；构想表位抗体可能特别灵敏；肿瘤产生变化多样的抗原，不同于自然抗原。
       但是我想从实际意义上向你们展示，我们在临床实验室中面对哪些问题。以下是现今经过标准化的所有肿瘤标志物的复杂性，抗原的描述，临床用途，及如何标准化。比如甲胎蛋白（AFP），是糖蛋白，其临床用途是肝细胞癌、生殖细胞肿瘤，而且是WHO标准化的抗原。所以我们可以仔细检查所有抗体，然后查看这个表（表3）。

       在临床实验室/CLIA实验室，我们知道必须执行能力验证（PT）。我们知道根据使用的能力验证材料，可能遇到问题。所以报告返回，列出所有厂商，列出我们的检测，以及是否有检测系统组（peer group）-与我们进行相同检测的10个或以上实验室。如果我们没有检测系统组，就会把我们跟所有方法比较，我们可能不及所有方法，而且我们什么也做不了。如果我们没有通过两个以上的能力验证，就不能再做这个检测了。必须停止使用这个检测，不能把它用于临床目的。可以重新使用这个检测的唯一方法就是，重新确认检测，获得新的能力验证材料。所以，我们不能那么简单地让能力验证失败，我们承担不起。因为作为实验室主任，如果我做PT失败了，比如说PSA，我不能在实验室检测PSA，一个癌症医院的实验室不能检测PSA，你知道这意味着什么吗？世界各地的人参与CAP CA125能力验证，都失败了。他们的失败不是说他们不懂得如何做检测，而是因为他们的检测方法与所有方法不一致，没有检测系统组。看一个例子（表4），CA125可以得到从71到176的结果。在一种特殊情况下，这个病人有非常严重的临床问题；在另外一种情况下，病人没有严重的临床问题。

CA125的结果范围从18到33。纽约州说红色数字超出了所有方法均
值，实验室都要考虑能力验证。

纽约州卫生局TM能力验证报告
2012年5月
CA125方法比较

图1：该图显示相对均值与所有方法结果的比较。换句话说，蓝条
中的结果与所有方法的差异有多大？所有方法的所有结果给出均
值。可以看到有些情况稍高，有些稍低，有些非常高，所以变异性
很大。但是，如果这个条中有10个或以上参与者，结果就是合格

的，因为它将与检测系统组比较，能力验证就不会失败。

CA 15-3的情况基本上与CA 125相同

纽约州强调的红色结果，最好做能力验证，因为与所有方法相比
较，超出了范围。

纽约州卫生局TM能力验证报告
2012年5月完成
当1+1=4时
CA 19-9方法比较

图2：从实际意义上，抗体和检测执行方式有所不同。此外，厂商

不希望有差异，但是它就是这样。基本上，CLIA实验室中的你们被
推进一个检测，很多人都在用这个检测，所以你们现在是来自检测
系统组。只要你在检测系统组，你们就不会失败，前提是正确地进
行检测。

纽约州卫生局TM能力验证报告
2012年5月
AFP方法比较

图3：并不太坏。一致性相当好。

图4：这个是不同的，记住，PSA是WHO标准化的检测。左图是所有
方法均值比较，但是右图用CV表示PSA相对变化水平。左图是任何
检测的差异，右图是基于实验室的检测差异。这是另一个问题。现
在，检测经过良好校准，可以获得相当接近的结果。使用同一方法

的实验室获得低或高的结果。就像在实验室检测葡萄糖，一个实验
室的结果是75mg/dl，另一个实验室的结果是100 mg/dl，这不应该
发生。但是，PSA会发生这种情况。所以，这些是收集和报告的数
据。

纽约州卫生局TM能力验证
2012年5月
个别方法%CV
方法平均%CV

图5：横坐标是不同的检测。图的左侧表示根据分析物不同每个方
法的平均%CV。所以，即使我们变得更好了，检测可以比较和一致
了，在PT方面还是有问题。这意味着有临床问题吗？可能不是。因
为PT材料的基质通常导致问题，放入材料的通常不是尿液，不是基
于尿液的材料，是基于牛科或其他的材料，因为这种材料或蛋白质
充当基质，检测才有问题。我们希望世界各地的PT机构使用一种常
见的基质，大家都使用相同的基质。如果我们这样做，PT报告会更
好。

四、PSA能力验证分析
PSA PT汇编和校准文件
表8. 不同的方法。例如，Abbott共有874个PT报告；Siemens: Dimension, ADVIA Centaur共有2千多个PT报告。

早期PSA检测的两个主要问题
       第一，PSA检测不是等摩尔检测–游离和复杂形式的PSA在有些检测中不能同等测量。人们懂得这一点，开始做等摩尔检测，检测变得更好。
       第二，对于样品中用比重法可测量的PSA量使用不同的参考标准，检测变得更好。
PSA发展成肿瘤标志物
       1980年王博士等人在Roswell Park通过免疫测定首次量化血清中的PSA。1992年，召开首届PSA免疫测定国际标准化斯坦福会议。1994年，Hybritech检测获得批准用于检测PCa（DRE（直肠指检），超过50岁的男性）。从那以后，使很多检测与Hybritech一致或相比较。1999年，报告了WHO国际参考制剂，使用了总PSA 96/670，游离PSA 96/668。 2003年，识别和报告了再标准化相关PSA结果差异的临床意义。

五、生物标志物或肿瘤标志物发展
在做生物标志物或肿瘤标志物开发时，所有答案必须是肯定的！
从分析上来说：
肿瘤标志物可以被准确和重现性测量吗？是的!
肿瘤标志物能区分正常情况和癌症吗？是的!
生物标志物检测经过标准化吗？是的!
从临床上来说：
生物标志物提供病人管理不能获得的另外信息吗？是的!
生物标志物将改善临床结果吗？是的!
如果你不做些什么来帮助临床医生管理病人，我们不会帮助临床医生，所以答案必须是肯定的。

六、结论
       应该鼓励肿瘤标志物标准化，因为这使得实验室间检测有临床价值，使临床合作可行，而且临床医生更容易接受数据。很多当前使用的肿瘤标志物的标准化可能是不现实的，因为实验室反对分割点（cut point）变化，并且难以确定抗原决定部位。但是，肿瘤标志物检测一致化是实际的解决办法，能够对不同的检测进行临床比较。肿瘤标志物和生物标志物的所有未来发展应该从检测的开始标准化。
                                                                                                                    编译、整理：王小茜

                                                                                                摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第四期
                                                                                                                        编辑：范伟伟