淋巴细胞亚群与乙型肝炎病毒感染

新佐罗

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染是全球重大的公共卫生问题，是造成慢性肝炎和肝病的主要病因之一。包括我国在内的亚洲地区为HBV 感染的高流行区，面临的乙肝流行趋势更为严峻。尽管目前对乙型肝炎发病机制的认识还不完善，但普遍认为HBV 病毒本身不具有细胞毒性，机体感染后出现的炎症反应和病理损伤主要与病毒作用下的机体免疫反应有关。其中，细胞免疫应答尤其是HBV 特异性T 淋巴细胞应答，对于病毒清除和疾病转归均有重要意义。随着研究技术的不断进展，对这些淋巴细胞数量和功能的体外研究，逐步推进了人们对于急慢性HBV 感染发病机制的认识，对于临床诊治的指导意义重大。

一、流式细胞术与淋巴细胞亚群检测
      目前，临床上主要通过体外间接检测方法来评估淋巴细胞的数量和功能，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）、流式细胞术（flow cytometry, FCM）等。其中FCM 因其独特的优势在临床应用日渐广泛。FCM 是自20 世纪70 年代发展起来的一种对液流中排成单列的细胞或其他生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。应用FCM 可测定细胞的大小、DNA/RNA 含量、细胞表面抗原表达等多种参数，也可进一步分类收集特定的细胞或细胞器，临床上将该技术广泛应用于感染性疾病、血液系统疾病、肿瘤学等多个学科。近年来，FCM 发展迅速，多色流式细胞术（polychromatic flow cytometry，PFC）能够同时检测多个细胞内外参数，已由20 世纪90 年代的5 色发展至目前的18 色先进PFC。
      根据细胞表面标志的不同，淋巴细胞可以分为T 淋巴细胞（CD3+）、B 淋巴细胞（CD19+）、NK 细胞（CD16+ CD56+）。其中T 淋巴细胞包括辅助或诱导T 淋巴细胞（CD3+ CD4+）、抑制或细胞毒T 淋巴细胞（CD3+ CD8+）；而CD3+ CD4+和CD3+ CD8+ T 淋巴细胞根据其标志及功能的不同， 还可进一步分为CD4+ 淋巴细胞纯真亚群（CD4+ CD45RA+ 62L+）和记忆亚群（CD4+ CD45RA-或CD4+ CD45RO+）、功能亚群（CD28+）、激活亚群（CD38+、HLA-DR+）、凋亡亚群（CD95+）等。这些淋巴细胞亚群主要代表了机体的细胞免疫功能，不同的亚群具有不同的临床意义。如CD4+ T 纯真亚群经特异性抗原刺激后，可转变为记忆亚群。CD28 是T 淋巴细胞正常激活所必需的协同刺激分子受体，因此CD28 的表达比例可用于衡量CD4+ T 淋巴细胞的功能。CD38 及HLA-DR 是T 淋巴细胞激活的分子标志，可用于评价细胞的免疫激活状态。CD95（Fas 受体）是介导细胞凋亡的主要受体之一，可用于评价细胞凋亡情况。此外，应用流FCM 还可以检测在特定抗原刺激下胞内细胞因子分泌及细胞增殖的情况，能够同时对细胞免疫的数量和功能进行研究和评价。

二、乙型肝炎病毒感染的发病机制
      人体感染HBV 后可出现不同的临床转归，大部分感染者呈急性感染后自愈的特点，少数出现感染迁延慢性化。而慢性HBV 感染根据临床特征、病毒血清学及生化学特征的不同，又可进一步分为慢性活动性乙型肝炎、慢性HBV 携带者、非活动性乙肝表面抗原（HBsAg）携带者等不同的亚型。目前，关于HBV 感染的免疫学发病机制仍存在很多未知的领域。但已有共识认为，HBV 本身并不具有细胞毒性作用，病毒感染后宿主机体的免疫反应才是影响病毒清除，导致炎症和病理损伤的主要原因。
      动物试验表明，随着HBV 感染后病毒复制水平的增加，首先出现的是机体固有免疫应答，即以NK 细胞和NK-T 细胞活化为主的炎症反应，随后才逐渐出现获得性免疫应答。在HBV 感染早期，机体固有免疫应答所产生的效应分子对于控制病毒传播、激活和调节下游效应细胞均有重要作用，在起始阶段即对感染的转归和预后产生影响。获得性免疫应答则包括B 淋巴细胞、CD4+ 辅助T 细胞、CD8+ 细胞毒T 细胞等多种类型效应细胞及其不同亚群的数量和功能调节。这些细胞在病毒控制和疾病进展中发挥重要的作用。其中辅助CD4+ T 细胞能够产生大量的细胞因子，这些细胞因子能够进一步激活诱导足量细胞毒CD8+ T 细胞的产生以及B 细胞抗体的生成。CD8+ T 细胞可以通过细胞毒性或非细胞毒性机制清除HBV 感染的肝细胞，从而减少血浆病毒水平；而B 细胞抗体则可以中和游离的病毒颗粒，防止发生再次感染。与急性自限性感染相比，慢性HBV 感染患者中往往合并存在淋巴细胞亚群比例失衡及细胞免疫功能紊乱， 其体内病毒特异性辅助CD4+ T 和细胞毒CD8+ T 细胞应答的特异性和强度都显著降低，从而导致HBV 清除障碍和感染慢性化。


三、T 淋巴细胞亚群测定在乙型肝炎病毒感染中的应用
      1. 急性自限性HBV 感染：人群中约95%的HBV 感染呈急性自限性过程，是HBV 自然感染中最常见的临床类型。对于急性乙型肝炎患者体内淋巴细胞亚群的研究很有限。部分研究表明，与正常对照者相比，急性HBV 感染初期外周血NK 细胞计数显著减少，而同期肝脏内的NK 细胞计数则明显增加。随着病毒控制和清除，急性期后NK 细胞计数又出现了缓慢回升。NK 细胞是机体固有免疫系统的重要成分，也是获得性细胞免疫的核心调节细胞之一。急性HBV 感染中，肝脏局部的NK 细胞募集可能对下游获得性免疫细胞的激活和肝脏炎症均有重要作用。
      急性自限性HBV 感染早期，外周血CD3+ CD8+ T 淋巴细胞总数也出现了明显上升。对这部分CD8+ T淋巴细胞功能的进一步研究提示，该群细胞对HBV 病毒蛋白成分中多个位点均可产生特异性细胞毒T 细胞应答。急性期后，随着病毒载量的下降和肝脏炎症的好转，外周血CD3+ CD8+ T 淋巴细胞计数也呈逐渐恢复的趋势，表明HBV 急性感染期内机体的细胞免疫应答处于上调和激活状态，其中强烈的多克隆HBV 特异性细胞毒性T 淋巴细胞应答对于清除病毒、控制疾病进程具有重要作用。
      2. 慢性HBV 感染：慢性HBV 感染包括慢性乙型肝炎、慢性HBV 携带者、非活动性HBsAg 携带者等不同转归的临床亚型。目前，HBV 感染慢性化的机制尚不明确。国内外初步研究提示，慢性乙型肝炎患者体内存在细胞免疫功能的失衡和紊乱，影响了机体有效清除入侵病毒的能力，导致病程迁延。但对于慢性HBV 感染者外周血淋巴细胞亚群的具体变化尚无定论，对慢性感染不同临床亚型的淋巴细胞亚群差异更是鲜有涉及。基于北京协和医院感染科建立的T/B 淋巴细胞亚群检测平台，我们对中国北方慢性HBV 感染者及其不同转归亚型人群的外周血淋巴细胞亚群进行了长期观察，并进行初步分析。研究显示，慢性乙型肝炎患者外周血中NK 细胞计数水平显著低于慢性携带者及正常对照者。如前文所述，NK 细胞作为固有免疫系统的重要组成和调节特异性应答的关键环节，其减少会直接影响病原相关的特异性细胞毒性T 淋巴细胞的功能活化。但是否与急性HBV 感染类似，同时存在肝脏局部NK 细胞的富集，需要进一步的研究证实。此外，研究还证实各组慢性HBV 感染人群外周血B 细胞计数与正常对照人群相比，差异无统计学意义，表明体液免疫可能不是造成慢性感染人群临床转归差异的主要因素。
      急性HBV 感染后，自愈者体内存在强度较高的HBV 特异性多克隆CD4+ 及CD8+ T 细胞应答；而慢性乙型肝炎患者体内相应的特异性应答宽度较窄，强度明显减弱，可能是造成病毒清除不力和疾病进展的主要原因。我们的研究表明，慢性乙型肝炎患者及慢性HBV 携带者外周血CD4+ T 淋巴细胞及CD8+ T 淋巴细胞计数均显著低于正常对照组，提示外周血中细胞免疫成分数量的下降且处于受抑状态。与文献报道不同，田瑛等的研究结果显示，慢性HBV 感染者外周血CD3+ CD8+ T 淋巴细胞数量显著减少；而对抗病毒治疗应答良好的患者随着其体内病毒载量的下降，可以观察到CD8+ T 细胞计数明显回升。
      与健康对照者和HBV 携带者相比，慢性乙型肝炎患者外周血CD8+ CD38+ T 淋巴细胞比例显著升高。对接受有效抗病毒治疗的慢性乙肝患者经2 年观察表明， 随着HBV-DNA 的下降，CD8+ T 淋巴细胞绝对值显著回升，CD8+ CD38+ T 淋巴细胞激活亚群的比例也随之显著下降。这提示在慢性活动性乙型肝炎患者体内存在T 淋巴细胞的异常激活；随着病毒载量的控制，这一异常激活也得到了有效的纠正。而慢性HBV 携带者体内虽然同样存在大量病毒，CD8+ CD38+ T 淋巴细胞激活亚群比例较正常对照组并无明显升高，表明携带者相对处于免疫耐受和静止的状态，这与我们对其临床症状和检验指标的认识是一致的。此外，慢性乙肝患者
和慢性HBV 携带者外周血CD4+ CD28+、CD8+ CD28+ T 淋巴细胞计数均有所减低，但比例保持稳定，且在抗病毒治疗后无显著改变。CD28 为T 细胞正常活化所必需的第2 信号，但与艾滋病病毒（HIV）感染导致CD28 分子表达低下不同，慢性HBV 感染似乎没有影响到CD28 分子的表达。田瑛等的研究结果表明，与正常对照组和HBV 携带者相比，慢性乙型肝炎患者外周血CD4+ CD45RA-记忆T 淋巴细胞比例显著升高，而CD4+ CD45RA+ 62L+ 纯真T 淋巴细胞比例及计数均显著减少。这一比例变化可能是由于慢性乙肝患者体内长期存在HBV 抗原刺激导致机体产生特异性细胞免疫应答， 从而出现记忆/效应T 淋巴细胞水平持续偏高。有研究进一步检测了慢性乙肝患者肝组织内纯真T 淋巴细胞亚群，发现HBV 感染的肝脏组织中CD45RA+ 62L+ 纯真T 细胞水平与血清病毒载量及肝脏炎症反应水平呈负相关，证实在慢性活动性乙型肝炎中，肝脏内纯真T 细胞贮存池处于相对耗竭的状态，有可能导致免疫应答水平低下而不能有效控制病毒。
      应用FCM 检测HBV 感染中T 淋巴细胞亚群的数量和比例， 是评估病毒感染后细胞免疫功能的一项重要手段，在临床上对急慢性乙型肝炎的诊断、治疗和监测具有重要意义。而应用FCM 对T 淋巴细胞效应功能的检测，更将为阐明HBV 感染的免疫学发病机制奠定重要基础，对于疫苗和药物研发、评价治疗时机和疾病预后都将具有更为深远的意义，值得进一步探索和研究。
                                                                                                               编辑：范伟伟