细胞因子检测技术进展

扬雷

　细胞因子是由造血系统、免疫系统或炎症反应中活化细胞产生的一种多功能活性蛋白质或糖蛋白,能调节细胞分化增殖和诱导细胞发挥其功能,在机体免疫应答中起着非常重要的作用。细胞因子由各种细胞分泌和表达,一些细胞因子表达在细胞表面或通过膜受体结合在细胞表面,大部分细胞因子被分泌到体液,是液相的可溶性细胞因子。细胞因子活性很高,而一种细胞因子常有多种生物学活性,因此有些学者把它作为一类激素。它为疾病的发病机制、诊断、治疗评价及预后评估提供有价值的信息,因此在临床免疫学中越来越重视细胞因子及其受体的检测。根据细胞因子作用特点及生物学效应,检测细胞因子的方法可分为3 大类:生物活性检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法。
生物活性检测法
      细胞因子生物活性检测是基于细胞因子特定的生物学效应,反映细胞因子在生物体内的活性状态,应用相应的指示系统和标准品来反映待测标本中某种细胞因子的水平,一般以活性单位表示。其检测大致分为细胞因子调节细胞生长活性、细胞因子介导的细胞毒活性、细胞因子抗病毒活性和细胞因子趋化活性等几类。细胞因子的生物活性检测法一般敏感性较高,直接表示待测标本中的活性水平,但由于实验周期较长,易受细胞培养中某些因素的影响,易受生物学活性相同或相近的其他细胞因子的影响,某些指示细胞对同一细胞因子的敏感性不同,所得结果难以标准化。该检测法特异性比较差,不能完全真实反映细胞因子的生物学效应。
免疫检测法
      细胞因子的免疫检测法是基于细胞因子抗原性、针对细胞因子的特异性抗体来定量或定性检测细胞因子的实验方法。免疫法可检测细胞内的、结合于细胞膜的和可溶性的细胞因子,但检测方法不同。
      1. 可溶性细胞因子检测法:主要有3 种,即放射免疫测定法( radioimmunoassay ,RIA) 、免疫放射测定法(immunoradiomet ric assay , IRMA) 、酶联免疫吸附实验( EL ISA) 。(1) 放射免疫测定法:检测细胞因子的放射免疫测定法通常用竞争抑制实验,其中液相的竞争抑制实验具有简便快捷、不需要洗涤的特点。竞争抑制实验应选择特异性高、亲和力强及滴度好的细胞因子抗体,且需要标记纯的细胞因子 。(2) 免疫放射测定法: 免疫放射测定发通常采用双抗体夹心法,将细胞因子抗体包被在固相载体上,加入待测样品,待细胞因子与包被抗体结合后洗去未结合物,用同位素标记的抗细胞因子抗体检测结合的细胞因子,其抗体必须经过纯化。IRMA 已经被证实为灵敏度高、特异性强、结果不受高浓度胆红素影响的检测方法。( 3 ) 酶联免疫吸附实验: 最早由Engvall 与Weeman 等同时建立并应用于医学研究,经过30 多年的发展,ELISA 技术日趋成熟,最经典的方法当属双抗体夹心法,由于酶标记物制备容易,制剂安全稳定,保存期长,不必接触放射线和处理放射性废物,其敏感度也可达到免疫放射法测定的水平,检测细胞因子和细胞因子受体的夹心ELISA 作为诊断工具和监控治疗的手段越来越重要 。
      细胞因子的夹心ELISA 技术是十分特异的,原因在于其中的抗体能有针对性地对抗2 个(或多个)相区别的表位。虽然夹心EL ISA 在细胞因子的检测中十分有用,但对EL ISA 数据的解释与分析仍有一定局限性,由于实验标本来源于组织培养上清液或体液,是由混合细胞群体产生的细胞因子。用EL ISA法不单独显示单个细胞产生的细胞因子的同一性与频率性,由于某些细胞因子的半衰期很短,分泌后很快被吸收,体液中EL ISA 法难以检测到。测定的细胞因子浓度反映的是细胞因子分泌的协同作用,由于细胞因子耐受细胞产生的细胞因子上升和细胞因子蛋白的降解,测出的水平可能显著地低估了潜在细胞产生的真实细胞因子抗体 ,由于EL ISA 法只能检测到具有免疫反应性的细胞因子蛋白的含量,而这些不能完全代表细胞因子生物活性的水平。
      目前,高度优化的细胞因子EL ISA 试剂盒已面市,它可以在检测标本时将干扰因素和非特异性反应降低到最低水平,使EL ISA 检测法的敏感性及特异性得到进一步提高。
      细胞因子的抗体芯片技术应用类似常规的酶联免疫反应的原理,将特异性细胞因子抗体按预定的顺序和阵列的形式排列在芯片上,将待测的标本稀释与之反应,再加入荧光标记的抗体,用计算机软件对荧光信号进行分析,即可获得准确的结果。细胞因子芯片的特点是一次实验能同时检测多个细胞因子和其他蛋白,灵敏度高,多数可达到pg 水平,样品需要量少,具有很高的特异性。细胞因子抗体芯片技术有诸多优点,但要成为实验室与临床普遍采用的技术,尚有一些问题需要解决,即如何简化样本的制备与标记操作程序及增加信号检测的灵敏度等 。细胞因子抗体芯片技术已成为国内外研究的热点,具有非常广阔的应用前景。
      2. 单细胞水平检测细胞因子的方法: (1) 酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assays , ELISPOT) :从单细胞水平观察细胞因子的表达已成为研究细胞功能的重要内容。EL ISPOT 采用可定量的夹心EL ISA 法,将特异性抗体包被在微孔板的聚偏氟乙稀( FVDF) 膜上,把经适当刺激的细胞加到孔中,37 ℃CO2 孵箱中温育,使已包被的抗体与分泌的待测因子结合,将生物素化的特异性检测抗体加入孔中,然后加入碱性磷酸酶,偶联的链霉亲合素加入底物溶液,即在细胞因子出现的位置形成并表现为黑蓝色斑点,每个斑点代表单个分泌待测细胞因子的细胞。相对于其他单细胞水平检测细胞因子分泌能力的检测方法,EL ISPOT 法更为简单、快捷、高效、重复性好,同时具有更高的灵敏度,比常规的EL ISA 法的灵敏度提高200 倍。EL ISPOT 操作简单,却可以提供非常类似于体内的实验环境,常常预示治疗或病理状态,成为研究细胞因子的一种非常重要工具,现已广泛应用于世界各大实验室的疾病诊断和科学研究工作中 。从理论上讲,所有能分泌细胞因子的细胞都可以用EL ISPOT 进行检测分析。实际应用中常见的检测细胞类型包括:外周血单个核细胞、骨髓或者中枢神经系统和淋巴组织的单细胞悬液。(2) 细胞内细胞因子流式细胞仪检测法:细胞因子流式细胞仪检测
法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合,以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞,测量其产生的散射光和发射荧光的强度,从而对分泌的细胞因子进行定量或定性检测的一种现代细胞分析技术。同时采用特殊的化学方法与抗体选择,确保静息的和无细胞因子的最小荧光背景,具有简便高效、灵敏度和精确度高、安全等特点 。这种方法对标本要求不高,只要是单细胞即可用于分析,而且在极短时间内可分析大量细胞,只要标本中的细胞数量足够,可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量。另外可同时分析单个细胞的多种特征,当同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息 。因此流式细胞仪检测是一种在医学基础、临床及科学研究中有着广泛应用前景的细胞分析技术。近年来,随着流式细胞仪性能的不断改进和测定方法与技术的迅速发展,流式细胞仪迅速进入临床实验室,在临床检验医学中的应用范围不断拓宽,一些检验项目已成为临床疾病诊断、治疗方案选择、预后判断等不可缺少的内容。
分子生物学检测法
      目前细胞因子的分子生物学检测法是研究细胞因子的重要手段,许多细胞的功能是通过基因表达的改变来调节的,信使RNA (mRNA) 检测是研究基因表达和功能的常用方法。从蛋白质水平来检测细胞因子经常因为细胞因子含量低而受到限制,所以mRNA 的检测广泛用于免疫反应及炎症过程中细胞因子水平的检测,但检测出的mRNA 水平不能完全代表细胞因子的蛋白水平 。有些出版物已经对通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 法检测和EL ISA 法检测细胞因子二者的关系给予了评价。
      作为低拷贝的片段,常用的细胞因子mRNA 检测法有Nort hern 印迹(Nort hern blot ) 、RT-PCR、核糖核酸酶保护分析( RPA) 等方法。Nort her blot 是mRNA 检测的经典方法之一,可半定量分析mRNA的水平,但由于需要时间长,难以进行多标本或多个靶mRNA 的同时检测。定量RT2PCR 是几种常用方法中最灵敏的一种,由于PCR 扩增本身的特性,要获得非常精确的结果十分困难。随着分子生物学的不断发展,低丰度细胞因子mRNA 含量检测(Quan-tikine mRNA) 和实时荧光定量PCR 技术( real time FQ-PCR) 取得了较大发展并应用到临床研究。
      1. Quantikine mRNA 检测法:Quantikine mRNA检测法是一种对低含量细胞因子特异性mRNA 进行定量的新方法,它应用类似EL -ISA 的基本原理,生物素和地高辛标记的探针在杂交板中与靶mRNA 或者标准mRNA 杂交,杂交后的产物转移到链霉亲合素包被的板孔中,杂交后靶mRNA 被捕获,加入AP 标记的抗地高辛抗体,然后加入AP 底物显色,酶标仪读取结果。此方法操作简单、灵敏度高、特异性强、所需时间短,使用传统酶标仪,无需放射性试剂,克服了传统mRNA 定量的特点,可进行高通量标本操作或在同一板孔中对多个mRNA 模块进行测定分析,而相互之间没有交叉反应或干扰 。
      2. 实时荧光定量PCR 技术:实时荧光定量-PCR技术是RNA 定量领域的创新,是通过对RT-PCR 扩增反应中每一个循环生物荧光信号的实时检测,从而实现对启始模板定量及定性分析。在实时荧光定量RT-PCR 反应中引入一种荧光化学物质,随着RT-PCR 反应的进行,PCR 反应产物不断累计,荧光强度也等比例增加,每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样就可通过荧光强度的变化检测产物量的变化,从而得到一条荧光曲线图。
      实时荧光定量-PCR 技术为组织液或细胞中mRNA 的检测提供一种敏感性、准确性很高、重复性好的实验方法,而且减少了PCR 反应过程中的污染,可进行高通量标本的操作。这项技术可以让科研工作者用一种快速、自动化方式获得免疫抑制及疾病方面的信息,毫无置疑地成为检测细胞因子的标准方法 。
      由于细胞因子的检测受到其生物学特性如局部性分泌、吸收利用率高、半衰期短等条件的限制,细胞因子的这3 种检测方法只有在一定条件下才有相关性,各种检测方法不能互相代替,联合使用这3 种方法,可使细胞因子的研究取得更大的发展;同时由于试剂厂家的不同及其他因素的影响,同样的标本所测细胞因子的水平可能有很大的差异,因此细胞因子检测的标准化以及质量控制问题应尽快规范。
                                                                                                                                               本文编辑：范伟伟

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谢谢楼主！