磁性微球在免疫学中的应用

钮留

磁性微球( Magnetic microspheres，MMS) 是近年来国内外研究的热点领域。因其具有诸多的优良特性，如粒径小、具有超顺磁性、表面可修饰等，而被广泛应用于生物医学方向，包括免疫学、靶向药物、靶向热疗等。其中，被应用于免疫学中的磁性微球，又被称为免疫磁性微球( Immunomagnetic microspheres， IMMS) 。它是通过表面修饰赋予微球表面特殊的功能基，如—OH、—COOH、—CHO、—NH2、—SH 等，这些功能基团可以与特异性免疫配基相结合，使抗体( 或抗原) 固定于IMMS 表面，利用抗原-抗体的高度特异性识别作用，形成“抗原( 抗体) -抗体( 抗原) -磁性微球”结构，从而应用于细胞分离、疾病诊断、食品和环境检测等领域。
1 磁性免疫分离
      1. 1 细胞分离  细胞分离是磁性载体早期的应用研究之一，自20 世纪70 年代以来得到迅速发展，用磁性载体进行细胞分离在细胞分离领域已占主导地位。它通过表面的单克隆抗体mAb 特异地与目标细胞表面的抗原Ag 结合，在外磁场的作用下，这些结合了IMMS 的细胞可发生定向移动，从而实现分离的目的。
      Molday是采用MMS 分离细胞的先驱者，他将含羧基磁性聚合物微球用荧光染料标记，经碳二亚胺活化，在其表面偶联抗体或外源凝集素，实现了对人红血细胞和B 淋巴细胞的成功分离。Spanová等采用分散聚合制备了磁性聚甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸缩水甘油酯微球，并在表面偶联沙门氏菌抗体，用于沙门氏菌细胞的分离和检测。李虹等成功地用直接磁分选技术分离出鼻咽癌组织中的T 淋巴细胞，为进一步进行肿瘤基质的分子生物学研究奠定了良好的基础。
      1. 2 蛋白质分离  以磁性聚合物载体为固相介质对蛋白质进行分离和提纯是一项新兴的蛋白分离技术。目前已经成功地对溶胞产物、血浆、原生质和腹水中的各种蛋白质如抗体、乳铁蛋白等进行了分离和纯化。蛋白质磁性分离采用的也是亲和作用原理，即将具有亲和作用的2 种分子中的1 种与磁性载体共价偶联，在目标溶液中特异性吸附或结合另一种分子( 即目标分子) ，通过磁场作用使它们( 载体和目标分子) 从混合物中分离出来，然后通过解吸使目标分子洗脱下来，从而达到分离和纯化的目的。
      石若冰等采用模板法制备的单分散磁性SiO2微球，用牛血清白蛋白( BAS) 作为模型进行磁性固定化金属亲和吸附蛋白的研究结果表明，BAS 在磁性亲和载体上的吸附可用Langmuir 吸附方程描述，饱和吸附量为90 mg /g。董海丽等采用磁性壳聚糖微球吸附的方法来吸附大豆乳清废水中的蛋白质，实验结果表明，在磁性壳聚糖微球投入量为25g /L、接触时间为10min、温度为30℃、pH = 5. 0 的条件下，能有效吸附大豆乳清废水中的蛋白质，吸附大豆乳清废水中蛋白质的去除率最高达95.6%。马力等用反相悬浮包埋法制备IMMS，表面包裹葡萄球菌蛋白A( SPA) ，从猪血清中分离IgG，SPA IMMS 对猪血清的最大吸附效率达到70. 12%，可反复使用29 次。Feng 等将三嗪染料活性蓝F3GA偶联在PMMA MMS 表面，用来吸附分离BAS，吸附量可达121. 98mg /g。
2 疾病免疫检测
      免疫检测是一种重要的现代生物分析技术，它对蛋白质、抗原、抗体及细胞的定量分析发挥着巨大作用。免疫检测的目的是确定溶液中免疫活性分子( 如抗原、抗体) 的浓度，其方法主要有放射免疫测定( RIA) 、荧光免疫测定( FIA) 、酶免疫测定( EIA) 等。利用抗体-抗原特异性可逆结合原理可以测定免疫活性组分的存在和浓度，但由于检测是在溶液中进行，彼此的分离比较困难，而利用磁性载体比表面积大、易分离、表面可修饰等优点，在荧光或放射性核素标记的磁性载体表面偶联抗体或抗原，制成一种磁性免疫检测试剂，可以非常简便、快速地对样品中的抗原或抗体进行定性、定量测定，被称为免疫检测方法的革命性发展。利用磁性聚合物微球结合的抗原或抗体进行免疫分析与检测，具有特异性高、分离快、重现性好等特点。
      Nakamura 等通过IMMS 技术检测了循环血液中的食管癌细胞，结果显示在47 名患者中有18 名可以检测到CK 反应性细胞，其检测率与病期紧密相关。Flatmark 等用IMMS 可在3h 内从含2 × 107个单核细胞的骨髓中筛选出微转移的结直肠癌细胞。王海青等以人源IgG 为肿瘤标记模型，成功地制备了一种高灵敏、高特异IMMS，对人源IgG 的最低检测值为50pg /mL。程琼等采用化学键合法将乙肝抗体固化在自行制备的纳米磁性高分子功能微球表面，利用免疫夹心反应原理，捕获溶液中的乙
肝表面抗原和标记有辣根过氧化物酶的乙肝第二抗体，检出限达0. 060ng /mL，灵敏度大大高于目前临床采用的酶联免疫吸附法。左国华等制备的IMMS 可与HepG2 细胞敏感而特异地结合，单个核细胞与HepG2 细胞比为1 × 106 ： 1时可检测到癌细胞，结合免疫细胞化学方法可检出外周血单个核细胞中57. 2%的微量癌细胞，无假阳性。
3 食品/环境微生物免疫检测
      免疫磁性分离技术在食品和环境卫生检测方面的应用也初见端倪。由于环境水样组分复杂，不仅含有多种非生物杂质，还含有多种非目标微生物，严重干扰目标病原微生物的检测; 而且环境水样中病原微生物的含量较少，无法直接检测，通常需对水样进行浓缩处理，但浓缩后常会加剧干扰物质对检测的干扰。食品检样常为固液多相混合体，采用常规方法难以将少量的致病微生物分离出来; 而借助免疫磁性分离技术可以达到快速分离的目的。将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样品中被检致病微生物发生特异性结合，载有致病微生物的磁性颗粒在外加磁场的作用下，向磁极方向聚集，弃去检样混合液，使致病微生物不但得到分离，而且也得到浓集。此方法具有分离速度快、效率高、操作简便、仪器设备简单、亲和吸附特异及高敏感性等特点，而且易于和现有的检测方法进行整合。由致病微生物引起的食源性疾病是食品和环境安全的最主要原因之一，由肠道致病菌污染食品和环境而引起的食物中毒以及疾病散发又是主要的食源性疾病危害。食品和环境检验中常见的致病菌有大肠杆菌O157： H7、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌等。
      Lyncha 等利用包覆了沙门氏菌抗体的Dynabeads 设计了自动免疫磁性分离系统，在低浓度染菌情况下，其在家禽肉类样品中检测沙门氏菌的敏感性比常规通过肉汤培养富集的方法高15. 5%。Kumar 等通过IMMS 分离水样中投加的沙门氏伤寒杆菌，提取DNA 后进行聚合酶链反应( PCR) 检测( IMS-PCR) ，发现采用IMS-PCR 检测比直接采用PCR 检测具有更高的灵敏性。Moreira 等也用IMMS 检测肉品种沙门氏菌取得很好的效果，检测限达到1 ～ 10CFU/25g。刘琳琳制备的IMMS，用于分离SPA 蛋白、免疫印迹分析，并捕捉金黄色葡萄球菌及其灵敏度实验，实验结果表明，该IMMS 能够成功地捕捉到金黄色葡萄球菌且检测下限可达100CFU/mL。
      唐倩倩等将MMS 与腺嘌呤核苷三磷酸( ATP) 生物发光法结合起来，对不同浓度的大肠杆菌E coli O157： H7进行了检测，得出该方法与传统的平板培养法具有很好的线性相关性，R2 = 0. 9882，检测限可低达102CFU/mL。Decory 等建立了免疫磁珠-免疫脂质体荧光试验方法能够在8h 内检测出多种液态样品中低至1CFU/mL 的E coli O157： H7。Liu 等通过磁珠分离技术与荧光实时定量PCR 技术检测空肠弯曲菌，解决了空肠弯曲菌生长缓慢甚至可能进入活的非可培养态而难以检测的问题。Lien等将免疫磁珠与PCR 结合，开发了自动化的病毒检测系统，结果表明，该系统的磁珠分离部件具有与RNA 提取试剂盒相当的病毒RNA 纯化能力，可检测的病毒浓度为100CFU/mL。
      免疫磁性微球作为一种免疫学与磁性微球技术相结合的新型功能复合材料，由于其在磁性分离、疾病检测、食品和环境检测等领域的应用中具有简便、快速、高效等优点，正吸引着国内外越来越多学者的关注。但目前免疫磁性微球的制备还不成熟，诸多方法各有利弊。相信随着高分子材料学、磁性颗粒的制备技术、免疫学等相关学科的进一步发展，必将加速推动对免疫磁性微球的研究，使之进入一个新的发展阶段。
                                                                                                                                          本文编辑：范伟伟