Presepsin(sCD14

老三

摘要 CD14存在于巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞及其细胞膜中，据说它是造成内毒素信号细胞内转换的原因。它的可溶部分存在于血液中且其产生被认为与感染有关。它被叫做可溶性CD14 亚型（sCD14-ST），下文以通用名称Presepsin表示。我们之前报道过Presepsin与感染有关并在脓毒病中特异性表达。在本研究中，我们利用化学发光酶免疫测定开发了一种新的诊断方法，能在更短的时间内进行自动化测量。使用这种方法测量不同病理情况中Presepsin值。正常人群：294.2 ± 121.4 pg/ml；局部感染：721.0± 611.3 pg/ml；全身炎症反应综合征：333.5 ± 130.6 pg/ml；脓毒症：817.9 ± 572.7 pg/ml；及严重脓毒症：1,992.9 ± 1509.2pg/ml。局部感染、脓毒症和严重脓毒症患者的Presepsin值比没有并发感染的患者高很多。在与基于ROC曲线的其他脓毒症诊断标志物的比较研究中，Presepsin的曲线下面积（AUC）是0.845，大于降钙素原（PCT，0.652），C反应蛋白（CRP, 0.815）或白介素6（IL-6,0.672）的AUC。另外，发现APACHE II评分（一种疾病严重性指标）与Presepsin值之间有显著相关，这表明Presepsin值可以充当密切反映病理学的参数。
关键词 脓毒病?SIRS?感染?可溶性CD14 亚型?Presepsin
前 言
      严重的情况，比如多发创伤、胰腺炎、腹膜炎和大面积烧伤，是急诊室和重症监室中最常见情况，次于这些情况的脓毒症的早期诊断是改善治疗结果的关键之一。脓毒症是一种全身炎症反应综合征，是伴随细菌感染引起的。类似的临床表现和试验结果常在非传染性炎症患者身上观察到，比如由多发创伤或大面积烧伤引起的炎症，使得单独依靠临床发现来诊断脓毒症变得困难。通过涂片或培养试验鉴别致病微生物对于感染诊断是必不可少的，但是这些方法并不总是有用的，因为获得结果需要时间，试验的敏感性低，以及不能排除污染。另一方面，近年来，降钙素原（PCT）、白介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF）被用作生物标志物，这些标志物在脓毒病患者的身上增高，虽然它们密切反映脓毒症的病理学，但是不能说它们有高特异性因为它们在高侵入性创伤患者身上暂时升高[1]。
      Presepsin被认为是脂多糖结合蛋白（LPS–LBP）复合物受体-CD14的一个片断，是应对细菌感染产生的。虽然它在体内产生的很多方面都是未知的，但是基于动物实验等的结果，应对细菌感染的吞噬作用可能起主要作用，而且根据酶抑制试验的结果，怀疑溶酶体酶，比如天冬氨酸蛋白酶（组织蛋白酶等），可能与产生机制有关。考虑到Presepsin有可能是脓毒症特异性产生的，我们之前进行过研究，把它与内毒素、IL-6、PCT和脓毒症的其他诊断标志物比较，并报告了其实用性[2-5]。之前使用传统的特异性酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒进行的研究结果表明Presepsin对脓毒症有高特异性而且在早期开始表达，其增高水平与脓毒症的严重程度成比例，其临床敏感性和特异性优于其他标志物[5]。不过，因为用这种方法测量需要预处理样本和5-6小时获得结果，速度在临床实践中是个问题，尤其是在急诊情况下，需要早期诊断。
      在本研究中，我们开发了一种新的化学发光酶免疫测定作为脓毒症的快速诊断方法。我们测量了各种病理状态下的Presepsin并比较了其作为脓毒症诊断标志物的实用性。
患者和方法
患者
      我们获得了参加这次研究的患者或其家人的知情同意以及Iwate医科大学伦理委员会的批准。研究时间是10个月，从2009年8月到2010年6月。这是一个前瞻性群组研究。受试者是41位住院患者（25位男性和16位女性），62 ± 19岁，被送到Iwate医科大学危重症护理和急救中心而且送来时已符合至少两个SIRS诊断标准。共收集6次血样，也就是入院时、12小时、24小时、3天、5天和7天后，然后测量Presepsin值。也测量了脓毒症标志物PCT、IL-6和CRP，作以比较。每次收集血样时，都根据持有日本感染控制医生学会证书的两位感染控制医生获得的临床数据做一次确诊。
      另外，作为对照，评估了128位健康受试者（100位男性和28位女性）。
      SIRS、脓毒症和严重脓毒症是根据美国胸科医师学会/危重症医学协会（ACCP/SCCM）制定的7个标准诊断的[6]。
      急性生理学和慢性健康评估II评分（APACHE II评分）[7]用作严重程度的指标。
测量方法
      使用包含乙二胺四乙酸（EDTA）的无内毒素注射器收集血样用于Presepsin测量。在收集样本后，（1）用微量移液管吸取100-μl全血到试剂样本孔内。（2）其中分配了样本的试剂被放在一个试剂架内，这个试剂架放在有特殊芯片的分析仪的机身里。（3）在25μl样本中加入25μl样本稀释液、50μl磁性乳胶试剂和50μl标记抗体试剂，在37℃反应5分钟。然后洗涤三次，每次用400μl冲洗液。（4）添加100μl发光底物，使酶反应在37℃持续1分钟同时测量发光。（5）测量样本中的Presepsin浓度，与作为样本经过相同程序处理的校准剂的发光光子量比较，然后用免疫测定分析仪（PATHFAST；日本三菱化工公司）自动执行步骤（3）-（5）[8]。当全血被用作分析仪的测量物质时，分析仪上的Presepsin值通过输入血细胞比容（Ht）自动校正。测量样本时Ht值被分别输入，然后进行校正。血浆也可以用作分析仪的测量物质。PCT的定量分析用自动化电化学发光免疫分析仪执行（Elecsys试剂，BRAHMS PCT；罗氏日本公司）。IL-6的定量分析用全自动免疫化学发光系统执行（Siemens Immulite IL-6；西门子德国公司）。CRP的定量分析用CRP-乳胶 X2 ‘‘Seiken’’执行（Denka Seiken，Japan）。
统计分析
      统计分析通过使用弗里德曼的X2r试验和带Bonferroni校正的威尔科克森t试验执行，数据表示为平均值±标准差。P值≤0.05被认为是显著差异的证据。另外，对每个生物标志物执行受试者工作特征曲线（ROC）分析并比较它们的脓毒病诊断性能。
结 果
      对照组128位健康人士的平均Presepsin水平是190 pg/ml。有41位患者（25位男性和16位女性）入院时符合至少两个SIRS诊断标准，在192个血样收集点评估这些患者。用作受试者的患者的背景因素见表1。我们在不同的点收集所有192份血样；不符合SIRS诊断标准且没有感染症状的患者群被分配到正常组，有感染但是不符合SIRS诊断标准的患者群被分到局部感染组。另外，根据ACCP/SCCM提议的定义，SIRS、脓毒症和严重脓毒症的分类结果是正常：22；局部感染：28；SIRS：41；脓毒症：87；和严重脓毒症：14。对应Presepsin水平如下：294.2 ± 121.4 pg/ml；局部感染：721.0 ± 611.3 pg/ml；SIRS：333.5 ± 130.6 pg/ml；脓毒症：817.9 ± 572.7 pg/ml；和严重脓毒症：1,992.9 ± 1509.2 pg/ml；局部感染或脓毒症患者的Presepsin水平显著高于有并发感染的患者（图1）。另外，未并发感染的SIRS的Presepsin水平显著低于脓毒症。

        图1 不同病理情况下Presepsin值的比较
      另外，发现APACHE II评分-一种疾病严重性指标与Presepsin值之间有显著相关（图2）。


        图2 Presepsin值与急性生理学和慢性健康评估II（APACHE II）评分之间的相关性
      四个脓毒症诊断标志物包括Presepsin的ROC曲线，感染组（局部感染组+脓毒症组+严重脓毒症组）和非感染组（正常组+SIRS组）见图3。从ROC曲线计算得来的Presepsin曲线下面积（AUC）是0.845；高于PCT 的AUC（0.652），CRP (0.815), 或IL-6 (0.672)。Presepsin的临界值设定为399 pg/ml，临床敏感性是80.3%和临床特异性是78.5%。 没有并发感染的SIRS患者和脓毒症患者的ROC曲线获得的AUCs是Presepsin,：0.845；PCT,：0.652; CRP：0.815;和IL-6：0.672;最好的结果是Presepsin（图4），当临界值设定为415 pg/ml时，临床敏感性是80.1%和临床特异性是81.0%，表明了Presepsin作为脓毒症诊断标志物的实用性。

        图3 四个脓毒症标志物包括Presepsin的ROC曲线，感染组（局部感
        染组+脓毒症组+严重脓毒症组）和非感染组（正常组+全身炎症反
        应综合症(SIRS)组）。CRP,C反应蛋白；IL-6,白介素6；PCT降钙素原
        以案例1为例。

        图4 四个脓毒症诊断标志物包括presepsin的ROC曲线，没有并发感
        染的SIRS患者和脓毒症组（脓毒症组+严重脓毒症组）
      患者51岁，男，因76%的身体大面积烧伤被送进我们的医院。入院检测数据包括白细胞（WBC）计数升高，为38,880/μl，并做了SIRS的诊断。由于入院时没有观察到Presepsin值（281 pg/ml）或PCT值（0.98 ng/ml）升高，而且血液培养呈阴性，没有结果表明那个时候有感染。入院第6天，通过血液培养分离葡萄状球菌。同一天观察到Presepsin和CRP值增加的趋势，还发现PCT值增加延迟了（图5）。

        图5 在烧伤患者中每个脓毒症标志物的临床过程

讨 论
      早期诊断和及时治疗对于改善感染的治疗结果是非常重要的，尤其是准确的诊断直接影响治疗方针的改变，比如药物选择或血液净化方法，取决于病原微生物。此外，耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌（MRSA）和多药耐药菌，比如多药耐药绿脓杆菌和抗万古霉素肠道球菌（VRE），近年来成为一个问题，毫不夸张地说对患者来说极其重要的预后取决于感染控制。用微生物试验检测微生物，比如血液培养，对于感染确诊是必要的，但是由于检测敏感性低，污染问题，以及培养本身不像在西方国家那么常执行，所以它们不一定是方便和实用的检测方法。另一方面，至今脓毒症的生物标志物和免疫标志物并不是很有效，近年来新的标志物被开发出来并广泛应用于临床环境。
      在本机构，我们测量和监控了感染的各种免疫标志物，尤其是脓毒症方面的。在一个PCT临床研究中，作为诊断细菌感染或评估严重程度的方法，我们获得了比CRP, TNF-a, IL-6等更好的PCT结果，而且我们确定了一种有关脓毒症的新诊断方法。PCT的生理学作用和产生部位尚未完全阐明，但是已证明在脓毒症期间它通常由甲状腺的C细胞产生。另一方面，在没有感染并发症的情况下PCT在高侵入性条件下也会增加，包括临床表现的综合评估在多发创伤和烧伤患者中是必要的。本研究观察到相似的趋势。
      Presepsin是脓毒症诊断的新标志物，以前一项使用ELISA试剂盒的研究结果表明在脓毒症早期特异性增加也与严重程度良好相关。但是，因为该试验方法需要预处理样本而且测量需要一些时间（大约5-6小时），以及只有回顾试验是可能的事实，所以它在紧急和重症监护中并不能起到有效的帮助，不能满足紧急和重症监护的要求速度。此外，基于2+或以上的数值被认为是阳性的免疫层析法原理，我们开发了一种便捷的诊断试剂盒，临床敏感性是73%和临床特异性是84%，有效性是80%。这种新的快速全血测量方法，使用化学发光酶免疫测定。因为用这个方法可测量全血，不需要预处理样本，所以可在很短的时间里进行测量。我们使用免疫测定分析仪来评估各种病理情况下Presepsin值的诊断价值。
      我们在本研究的不同点进行所有血液收集，并把它们分成正常、局部感染、SIRS、脓毒症和严重脓毒症。根据每次血样收集时的诊断Presepsin值的比较结果表明正常组和未并发感染的SIRS组的Presepsin远远低于局部感染、脓毒症或严重脓毒症，表示Presepsin在感染情况下特异性增加。在以前的研究中，这种标志物的值在感染情况下有非常大幅度的变化，甚至有数值超过测量限20,000 pg/ml的案例，好像是这种标志物的一个特征。另外，因为Presepsin值在严重脓毒症中特别高，而且APACHE II评分作为严重程度指标和Presepsin值之间存在正相关，所以推测Presepsin值密切反映了脓毒症的病理学。根据这种测量方法和诊断脓毒症的临界值。当我们设定脓毒症的Presepsin临界值为从ROC曲线计算而来的415pg/ml时，临床敏感性是80.1%和临床特异性是81.0%，因此大约400 pg/ml似乎是有效的。关于临界值需要进一步研究。
      当我们把患者分成感染组和非感染组以及绘制每个标志物的ROC曲线来比较Presepsin与其他标志物时，结果表明Presepsin是最好的，其次是CRP, IL-6，和PCT。此外，当患者被分成没有感染的SIRS组和脓毒症组而且以相同方式绘制ROC曲线时，结果再次表明Presepsin是最好的。在本机构以前进行的一项研究中，我们报告了PCT是比CRP 或 IL-6更有效的诊断脓毒症和监控治疗的参数。在本研究中PCT结果不出众的原因好像是，有12例严重烧伤和多发创伤等，也就是指入院时未并发感染的SIRS，大约占总患者数量的30%。因为PCT水平增加反映了在没有感染症状的情况下在创伤早期机体对创伤刺激的反应的严重程度，所以它不一定以感染特有的方式增加；这好像是在本研究的案例中PCT对于感染的诊断性能低的原因。另一方面，入院时未并发感染的所有SIRS患者的Presepsin值都低于500 pg/ml，甚至在创伤非常具有侵入性的患者中这个数值也不高，除非有并发感染的情况。在这方面，与PCT和促炎细胞因子比如TNF, IL-6，或 IL-8相比，可以说Presepsin具有高度疾病特异性。
      在本研究中，我们获得了与传统ELISA方法相似的结果，通过使用免疫测定分析仪有可能更快速和便捷地诊断脓毒症。我们目前正在一个多中心临床研究中使用这种分析仪，而且正在对各种病理学情况进行进一步临床动态分析。基于本研究的结果，看似Presepsin不久将在临床环境中被广泛用作脓毒症的诊断标志物。

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                                                                                                  摘自定向点金《临床实验室》杂志2012年第十期
                                                                                                                     编辑：范伟伟