最新研究——免疫沉淀的改进新方法

姑姑机

免疫沉淀是研究蛋白质常用的技术，是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。　　如果蛋白样品在孵育抗体前未经珠子预处理，会导致一些非特异蛋白与ProteinA/G结合，从而干扰试验结果。另外如果同时加入抗体和珠子，有时会出现沉淀效率不高的情况。
　　方法改进：
　　1、预处理：在加入抗体和珠子之前，加入20-30微升50%浓度的珠子悬浮液于蛋白裂解液中，4度摇床孵育一个小时。对于经常做IP或者CO-IP的实验室，可以将同一种样品第一次预处理所用的珠子收集起来置于四度保存，以备下次沉淀同样蛋白裂解液时预处理用。
　　2、抗体，珠子分别孵育。先将适量抗体加入蛋白裂解液中，4度摇床孵育过夜。然后加入适量珠子，4度摇床孵育2到3个小时。