Rta：一种新的鼻咽癌血清学特异诊断靶标

狐仙

Rta分子生物学特征
      自Kenney于1989年提出EBV裂解期基因BRLFl表达对病毒基因组的反式激活作用以来，越来越多的证据显示BRLFl基因编码蛋白Rta在鼻咽癌病变过程中扮演了重要的角色，能反向激活EB病毒潜伏期的各个基因和下游的一系列基因，并进一步引发了裂解感染各期基因的“瀑布式表达”，诱导鼻咽部细胞发生异常分裂产生癌变。
      Rta是聚合状蛋白质，由605个氨基酸组成，分子量大（66594.6Da），化学成分复杂、抗原表位表露。它是DNA序列特异性转录活化剂，能够在B淋巴细胞以及上皮细胞中有效的激活EB病毒进入裂解复制状态使其进入裂解期，启动下游基因BMRFl(持续合成因子)，BHRFl(细胞凋亡抑制因子)等的表达。Rta蛋白还参与炎症过程，并通过与细胞因子相互作用，调节宿主细胞的分化增殖。因此该蛋白的致病机理是通过转录激活途径使病毒由潜伏期进入裂解期。用合成肽与EBV阳性个体的外周血淋巴细胞相作用，分析Rta蛋白的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte, CTL)表位，结果表明，Rta蛋白至少有8个位点可以被EBV特异的CTL细胞识别，有7个相关的HLA型别己确定，有很强的抗原性，引发人体产生相应的免疫球蛋白抗体。
      EB病毒抗体主要分为IgA和IgG两类，这两类抗体对鼻咽癌诊断的效率有所不同，通常IgA类抗体对检测样本的特异性较IgG类抗体高但灵敏度偏低。将Rta蛋白的IgA和IgG抗体的检测性能进行比较，结果显示IgG／Rta检测灵敏度较高（表2）。
         表2 血清Rta抗体IgG和IgA检测诊断鼻咽癌效率比较

      Feng等用Western Blot方法鉴定出Rta蛋白C末端既是转录激活区域又是IgG的结合表位，因此IgG更适合作为Rta蛋白的检测抗体进行筛查，以Rta蛋白为检测抗原建立的ELISA方法具有较高的应用价值。
BRLF1表达产物Rta蛋白是鼻咽部细胞癌变的早期特异性标记物
      2000年新加坡国立大学Feng等用RT–PCR的方法对主要的EBV裂解基因在鼻咽部活检组织（包括肿瘤组织和正常组织）当中的表达情况进行研究，发现在NPC样本和对照中BZLF1、BALF2和BCLF1均能检出，只有BRLF1在NPC样本中检测出，而正常组织中未能检出。因此，Rta蛋白在体内的抗体具有很大潜力成为鼻咽癌的早期诊断及筛查指标。

            图2 EB病毒裂解基因在鼻咽部活检组织当中的表达
             NPC：鼻咽癌组织； Control：正常鼻咽部组织
      接着，Feng等用基因重组技术表达纯化BRLF1基因两个片段，获得R185I和R150I两种重组融合Rta蛋白质，将两种融合蛋白混合作为抗原，用免疫沉淀方法检测了53例未经治疗的鼻咽癌病人和53例正常对照人血清中Rta蛋白IgG抗体，结果在53例鼻咽癌病人中，有44例检出IgG-Rta，检测敏感性为83%；53例对照中仅有1例正常人检出IgG-Rta，显示其检测鼻咽癌特异性高达98.1%。这一结果表明了检测EB病毒Rta蛋白抗体作为鼻咽癌肿瘤标记物的巨大潜力。
      2006年中国疾病预防控制中心曾毅院士的研究组用表达和纯化的BRLF1基因C端2/3部分Rta蛋白(Rtac2/3)建立间接ELISA方法，检测血清中的抗Rta/IgG抗体。结果显示59份NPC患者血清中50份阳性，灵敏度为84.7﹪；而59份健康者对照血清中只有7份阳性，特异性为88.1﹪，NPC组的阳性率与健康对照组之间差异有统计学意义( P ＜ 0 . 0 1 )。上述结果进一步验证了检测人血清中的抗Rta-IgG可以作为NPC诊断的重要标志物之一，用于NPC的筛检和诊断有很高的灵敏度或特异性。
      2007年北京同昕生物的研发团队筛选出Rta蛋白抗原决定簇丰富且抗原性高、与人类蛋白质没有同源性的区域，通过大肠杆菌进行表达制备，获得纯化的Rta抗原，使用酶联免疫法（ELISA）制作出EB病毒Rta 蛋白抗体IgG检测试剂盒，先后经过近2500多例人血清的临床检测试验，结果显示检测鼻咽癌的灵敏度为81%，特异度为92%，阳性预测值为89.7%，阴性预测值为85.1% 。对检测数据进行ROC曲线分析，所得ROC分析结果如图1所示曲线下的面积为0.886，95%置信区间为0.863到0.909，说明试剂的诊断有意义。计算各判定值时的约登指数，以约登指数最大点为判定值最真实点。约登指数=灵敏度+特异性-1。计算结果在取判定值0.1033和0.1045时，约登指数最大为0.723。ROC分析最佳灵敏度与特异性性选择点与预设判定值基本相符，证明了ELISA法检测血液中EB病毒Rta蛋白抗体IgG在鼻咽癌诊断中具有早期、敏感、特异和方便的临床诊断价
值，适用于筛查、辅助诊断及治疗效果监测（图3）。该公司将此项创新研发成果产业化，生产出《EB病毒Rta 蛋白抗体IgG检测试剂盒（酶联免疫法）》，获得国家药监局产品注册证（国食药监械(准)字2009第3400893号）供临床诊断鼻咽癌使用。

           图3 Rta/IgG抗体检测诊断鼻咽癌的ROC曲线
      我国多个肿瘤专科医院和研究所使用北京同昕的Rta试剂盒进行了鼻咽癌诊断的测试研究，得出一致的结论，即采用ELISA方法检测血清中Rta/IgG抗体可以作为检测EB病毒的一个新指标，并可作为鼻咽癌诊断的重要标志物之一。
      首先是四川华西医大张林教授领导的研究组进行了一系列的深入研究，从多个方面论证Rta蛋白抗体对鼻咽癌诊断的灵敏度和特异性，在鼻咽癌分期、性别、年龄方面Rta蛋白抗体的变化，在健康人和其它癌症患者中Rta蛋白抗体的水平，以及在不同治疗周期Rta蛋白抗体水平的动态变化等等。作者收集2006年8月—2008年2月在华西医科大学附属肿瘤医院住院的未经治疗的鼻咽癌患者血清标本274例，其中男性202例，女性72例，年龄范围14—79岁。全部病例均经病理组织学检查获得确诊。临床分期按1992年福州方法进行分期。放疗后不同治疗周期（分别为1周、2周、3周和4周）的血清36例。非NPC病人组有传染性单核细胞增多症、何杰金氏淋巴瘤、喉癌、肝癌、胃癌食管癌、肺癌、乳腺癌及宫颈癌患者（以上病例全部未经过治疗）。健康对照组为健康体检者的血清标本353例，其中男性253例，女性100例。年龄范围28—83岁。实验组与对照组之间性别、年龄相匹配，各组间具有可比性。结果显示，Rta-IgG鼻咽癌检测阳性率（灵敏度）为90.5%，特异性为91.8%；Rta-
IgG表达水平与鼻咽癌患者性别、年龄无关；鼻咽癌患者放疗前血清Rta-IgG表达水平与临床分期、TNM分期无关，提示Rta蛋白抗体IgG并不随着鼻咽癌病人的分期越高而表达增加,与鼻咽癌的发生发展、浸润及转移相关性值得进一步探索，与文献报道一致，尚不能认为其与分期有关，有待进一步的研究。
      迄今为止，放射治疗是治疗鼻咽癌最有效的方法。作者经过追踪观察发现患者经过一个周期的放射治疗，大量的癌细胞就被杀死，Rta的表达就跟着降低。鼻咽癌患者血清Rta抗体水平经过放射治疗后明显下降，提示应用Rta抗体检测可以监测鼻咽癌的治疗效果（图4）。

图4 应用Rta抗体检测可以监测鼻咽癌的治疗效果
      作者还观察到Rta-IgG在与EB病毒密切相关的非鼻咽癌疾病和肿瘤中的表达与正常人没有显著性差异，进一步证明了Rta-IgG检测鼻咽癌的独有的特异性（表3）。用ELISA法检测鼻咽癌、传染性单核细胞增多症以及何杰金氏淋巴瘤、喉癌、肝癌、胃食管癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌等EB病毒相关的肿瘤病人血清中Rta-IgG，结果显示鼻咽癌病人阳性率远高于正常人水平，具有显著性差异（p<0.001）；而传染性单核细胞增多症和多数其他癌种的阳性率值却与正常人水平无异。虽然其中何杰金氏淋巴瘤和乳腺癌的Rta抗体略高于正常人水平,但无显著性差异（p>0.05）。鼻咽癌检测阳性率高于所有其他癌种的阳性率, 具有显著性差异（p<0.01）。

      2009年广西梧州市肿瘤防治研究所和广西梧州市红十字会医院的郑裕明研究组发表论文报告使用北京同昕的Rta-IgG酶联免疫法试剂盒检测了211例未经治疗的鼻咽癌患者的血清和413例对照组（包括203例相似症状的非鼻咽癌病例和210例健康体检者）的血清，结果证明鼻咽癌组的Rta/IgG抗体rA值中位数明显高于对照组(P<0.001)。Rta/IgG抗体检测诊断鼻咽癌的ROC曲线下面积为0.933，最佳截断点时敏感度为90.5％，特异度为90.1％。
      同年，广西医科大学肿瘤医学院崔英研究组发表论文，报告使用北京同昕的Rta-IgG酶联免疫法试剂盒检测274例鼻咽癌未治疗患者及353例健康体检者血清中Rta-IgG水平，两组比较有明显的统计学差异性（p<0.01），检测鼻咽癌的敏感度为82.1%，特异性91.8%。也确认Rta-IgG表达水平与鼻咽癌临床分期（按1992年福州方法进行分期）没有关系。朱文良等收集2007年8月—2008年2月在广西医科大学附属肿瘤医院住院的肝癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤初治血清标本各20例，测定其Rta-IgG抗体水平，亦证明其他癌种的阳性率值虽高于正常人水平，但无显著性差异（p>0.05）。鼻咽癌阳性率高于其他癌种的阳性率, 具有显著性差异（p<0.001），彰显Rta-IgG对于鼻咽癌诊断及鉴别诊断的临床意义（表4）。

      2010年广东中山大学免疫学专业曹开源教授指导的研究生陈文思发表硕士论文《EB病毒重组抗原Rta蛋白的表达及其在鼻咽癌筛查中的应用》，报告通过毕赤酵母表达系统高效表达的立早基因BRLFl的产物Rta蛋白为抗原用ELISA方法检测鼻咽癌和正常对照组血清中的Rta-IgG抗体，同时对其在鼻咽癌筛查中的价值进行了评估。作者检测300例经临床病理确诊且未治疗的鼻咽癌血清标本；500例健康对照人群血清标本，显示诊断鼻咽癌的敏感性为92.7％,特异性为94.6％。
Rta与其他几个EB病毒靶标的临床应用比较
      Rta问世以来，先后有很多研究单位对Rta在鼻咽癌诊断上的应用价值通过临床试验与其它的EB病毒靶标做过分析比较。Feng等和曾毅研究室[44]先后对使用Rta-IgG抗体酶联免疫法（ELISA）和使用VCAIgA免疫酶法（IE）做过比较，结论是两者在诊断鼻咽癌的灵敏度和特异性方面相差不多，但认为前者方法简便，结果客观，更适于大量样本的筛查。
      曾毅等使用ELISA方法检测血清中两个EB病毒立早基因编码蛋白抗体Rta-IgG、Rta-IgA、Zta-IgG，结果显示，检测Rta-IgA时，特异性高达100%，但灵敏度仅44.1%，用于鼻咽癌筛检的意义不大。在检测Rta-IgG时，灵敏度为84.7%，特异性为88.1%，阳性预测值87.7%，因性预测值85.3%，适于鼻咽癌筛查和辅助诊断。若与Zta（Zebra）蛋白联合使用，如果并联使用（Rta和Zta其中一个阳性即为阳性，二者都阴性判断为阴性），则灵敏度达到96.6%，阳性预测值83.8%，阴性预测值达到96.0%。如果串联使用（Rta和Zta界为阳性判断为阳性，二者之一有一个阴性即为阴性），则特异性高达96.6%，阳性预测值95.9%。而单独检测Zta-IgG的阳性预测值和因性预测值均为89.98%（如表xx所示）。作者结论是：间接ELISA法检测抗Rta-IgG抗体可以作为检测EB病毒的另一个新的指标，用于鼻咽癌的筛查和诊断，能够增加诊断的准确性，并且能给检验者和临床医生提供更多的信息。
      蔡永林等采用ELISA方法比较过Rta/IgG和NA1/IgA抗体在检测鼻咽癌中的应用，同时又和采用IE方法的VCA/IgA、EA/IgA做了比较。根据ROC曲线，确定4个抗体的诊断界值分别为VCA/IgA≥1:10、EA/IgA≥1:10、Rta/IgG rA≥0.49、EBNA1/IgA rA≥0.26。单个抗体检测诊断鼻咽癌的各项评价指标结果见表5。

      蔡永林等的研究结果显示，单一指标而言，使用IE法的VCA/IgA的敏感度最高，其余3项的敏感度相似；而使用IE法的EA/IgA的特异度最高，其它3种抗体的特异度相近。作者认为由于没有一个指标达到理想的鼻咽癌早期诊断的目标，建议使用多指标联合检测。作者应用基于logistic回归模型的ROC曲线分析方法，评价传统的IE法检测的VCA/IgA和EA/IgA、以及新建立的ELISA法检测的NA1/IgA和新发现的标志物Rta/IgG等4种EB病毒抗体不同组合对鼻咽癌的诊断价值后认为，多指标联合诊断试验的确有助于提高诊断效率，各项指标组合的敏感度和特异度均有所提高。但从成本-效益的角度讲，立早基因抗原Rta/IgG抗体和抗晚期抗原VCA/IgA抗体联合检测可更大范围地反映EB病毒溶解感染期的抗原表达，具有很好的互补性，使诊断鼻咽癌的敏感度提高到94.8% (90.9%~97.4%)，特异性提高到98.0%(95.0%~99.4%)。VCA/IgA和Rta/IgG可能是鼻咽癌临床血清学诊断最有效的组合之一。
      陈文思采用ELISA方法比较过Rta-IgG和NA1-IgA抗体在检测鼻咽癌中的应用，检测未经治疗的鼻咽癌患者血清300例，正常人血清500例，结果显示Rta-IgG抗体检测鼻咽癌的灵敏度高达92.7%，特异性为94.5%；VCA-IgA单独检测虽然有较好的敏感性(76.3％)，但其在健康人群里10％左右的检出率提示特异性较差（89.6%），对鼻咽癌诊断还存在明显不足。而近年应用于临床检测的NAl是一种特殊的病毒蛋白，为潜伏期EBV DNA复制所必需，研究表明，NAl作检测抗原具有良好的特异性(87.93％)，但灵敏度较低(56.8％)，容易出现漏检情况。作者也主张两种标志物联合检测，互相弥补缺陷，可进一步提高检测的准确性。作者综述至今为止的研究成果指出，对于将哪两种抗体进行联合检测，至今尚存争议。有学者建议检测NAl/IgA联和VCA/IgA，另一种建议则是联合EA/IgA和VCA/IgA，不管何种筛查方案都还存在灵敏度或特异性等不尽人意的问题。为此，作者提出NAI/IgA和Rta/IgG联合检测是从理论上和实践上最理想的组合，因为它既能体现机体对EB病毒潜伏感染下的反应，又能反映病毒裂解期尤其是肿瘤存在下的感染情况，具体的临床应用价值还有待后续研究中进一步探讨。