SLE相关自身抗体临床检测质量控制体系的建立及临床研究

财小弟

曾小峰 教授：
1962年6月25日生。1979年考入上海第一医学院医学系基础医学专业，1984年7月毕业后一直在北京协和医院工作。1989年9月至1990年2月任内科总住院医师。1989年12月晋升为主治医师，1995年4月晋升为副主任医师，1999年9月破格晋升为主任医师。1994年4月获日本第38届风湿病学会颁发的国外青年学者奖。同年还获第十五届国际变态反应和临床免疫学会（IAACI）颁发的国际旅行奖。
1995年9月至1996年2月曾获Ivy Wu Fellowships到香港大学进修免疫病理学并获结业证书。1998年5月至1998年9月参加卫生部战略合作伙伴计划到加拿大Janssen-Ortho Inc.系统学习GCP（Good Clinical Practice），并获成绩优秀证书。目前已发表文章150余篇并参与了《中华内科学》、《内科学》八年制全国统编教材、《中华风湿病学》、《现代急诊医学》、《临床风湿病学》等专著的编写。完成多项国家级及部级以上科研课题，课题“类风湿关节炎早期诊断的血清学研究和临床应用”获2005年中华医学科技奖三等奖。目前为“十一五”国家科技重点支撑项目系统性红斑狼疮（SLE）的临床诊断、综合治疗的研究（课题号2008BAI59B02）负责人，此外还负责承担国家十一五科技重点支撑项目子项目一项。现任北京协和医院内科学系副主任、北京协和医院风湿免疫科副主任、博士生导师、中华医学会风湿病学分会副主任委员、中华医学会内科学分会常委兼秘书长、北京医学会风湿病专业委员会主任委员、中国康复医学会骨与关节及风湿病分会副主任委员，北京医学会常务理事、中国软组织疼痛学会主任委员、北京医师学会理事、北京免疫学会理事、中国临床免疫学会委员。为《中华临床免疫与变态反应学杂志》副主编，《中华风湿病学杂志》、《中华内科学杂志》、《中国免疫学杂志》等10余份杂志的编委。

《临床实验室》：曾教授，您好！非常感谢您能接受我们的采访，临床实验室杂志的读者主要以检验科为主，根据不同主题也会向相关临床科室增发，最近听说北京协和医院风湿免疫科承担了国家“十一五科技支撑计划项目”中系统性红斑狼疮的临床诊断、综合治疗研究（课题号2008BAI59B02）的课题，科研经费共计高达715万元人民币，该课题是由您负责的，首先请您详细介绍一下这个课题具体研究的内容？
曾小峰教授：首先，我先解释一下什么是国家科技支撑计划。国家科技支撑计划是为贯彻落实《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020）》（以下简称《纲要》），主要面向国民经济和社会发展需求，重点解决经济社会发展中的重大科技问题，并在原国家科技攻关计划基础上设立的国家科技计划。国家科技支撑计划主要落实《纲要》重点领域及其优先主题的任务，以重大公益技术及产业共性技术研究开发与应用示范为重点，结合重大工程建设和重大装备开发，加强集成创新和引进消化吸收再创新，重点解决涉及全局性、跨行业、跨地区的重大技术问题，着力攻克一批关键技术，突破瓶颈制约，提升产业竞争力，为我国经济社会协调发展提供支撑。国家科技支撑计划由科学技术部会同财政部制定支撑计划管理办法。科技部负责支撑计划的组织实施，其中有关医疗卫生方面的项目由卫生部直接领导组织。
      国家“十一五科技支撑计划项目中，常见风湿免疫病和变态反应疾病早期诊断与规范化治疗的研究项目是我国在自身免疫病方面首次投入临床研究的重大课题。旨在对目前在我国危害性大，在风湿免疫疾病和变态反应疾病中最被关注和较常见的几
个疾病中的自身抗体试剂的开发，提高早期诊断率，通过对临床资料的分析，制定诊断标准，通过对治疗的观察制定规范化治疗方案。其中设立了系统性红斑狼疮的临床诊断、综合治疗的研究课题。这是目前国家投入系统性红斑狼疮临床诊治研究的最大一项课题。由我具体负责，到现在为止，包括北京协和医院在内的全国80家三级甲等医院参加此项课题，囊括了我国目前最优秀的风湿免疫病诊治中心。
      国家“十一五”科技支撑计划项目中有关系统性红斑狼疮课题的研究内容为：（1）研究系统性红斑狼疮相关生物标志物及其检测方法；（2）系统验证和评价生物标记在疾病诊断、鉴别诊断和预后判断等方面的临床应用；（3）制订联合治疗方案，观察轻中度狼疮及重度狼疮的疗效和不良反应。
      研究目标为：（1）建立系统性红斑狼疮生物标志物高度敏感性及特异性检测方法；（2）制订系统性红斑狼疮生物标志
物临床检测的质量控制标准；（3）建立适合中国人群的系统性红斑狼疮疾病活动和重要脏器受损的评估标准；（4）建立符合中国国情的系统性红斑狼疮临床综合治疗的规范。最终提高我国系统性红斑狼疮的诊治水平，改善系统性红斑狼疮病人的预后及降低系统性红斑狼疮病人的死亡率，确立我国的系统性红斑狼疮的诊治指南。


《临床实验室》：我大概知道什么是红斑狼疮，但不是非常具体，您能详细介绍一下这个疾病的危害性吗？
曾小峰教授：系统性红斑狼疮是“风湿这类自身免疫病最常见的一种，它是自身免疫介导，以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病。血清中出现以抗核抗体为代表的多种自身抗体和多系统累及是系统性红斑狼疮的两个主要临床特征。系统性红斑狼疮好发于生育年龄女性，多见于15-45岁年龄段，女男比例为（7-9）：1。系统性红斑狼疮的流行病学在美国多地区的调查报告，其患病率为（14.6-122）/10万人，北京和上海的流行病学调查表明，我国系统性红斑狼疮的患病率为（40-70）/10万，以此推算，我国目前有52-91万系统性红斑狼疮病人。系统性红斑狼疮在“风湿”中病情最复杂、最严重，预后最差。不定期随诊、不遵循医嘱、不规范治疗是致死的重要原因。近年来，由于加强了对病人的教育，以及诊疗水平的提高，系统性红斑狼疮的预后与过去相比已有显著提高。经正规治疗，1年存活率为96%，10年存活率已超过90%。急性期病人的死亡原因主要是系统性红斑狼疮的多脏器严重损害和感染，尤其是伴有严重神经精神性狼疮和急进性狼疮性肾炎者；而慢性肾功能不全、药物（尤其是长期使用大剂量激素）的不良反应和冠状动脉粥样硬化性心脏病等，是系统性红斑狼疮远期死亡的主要原因。


《临床实验室》：临床实验室杂志侧重于临床实验诊断，请您详细谈一下系统性红斑狼疮在实验室检查中都包括哪些？
曾小峰教授：在1997年美国风湿病学会修订的系统性红斑狼疮分类标准中，明确将血液学异常、免疫学异常和自身抗体阳性等实验室检查列入了诊断标准。主要包括：
（1） 常规检查：由于系统性红斑狼疮病人常可存在多系统受累，如血液系统异常和肾脏损伤等，血常规检查可有贫血、白
细胞减少、血小板降低；肾脏受累时，尿液分析可显示蛋白尿、血尿、细胞和颗粒管型；红细胞沉降率（血沉）在系统性红
斑狼疮活动期增快，而缓解期多可降至正常。
（2） 免疫学检查：50%的系统性红斑狼疮病人伴有低白蛋白血症，30%的病人伴有高球蛋白血症，尤其是γ球蛋白升高，
血清IgG水平在疾病活动时升高。疾病处于活动期时，补体水平常减低，原因是免疫复合物的形成消耗补体和肝脏合成补体能力下降，单个补体成分C3、C4和总补体溶血活性（CH50）在疾病活动期均可降低。
（3） 生物化学检查：系统性红斑狼疮病人肝功能检查多为轻中度异常，较多是在病程活动时出现，伴有丙氨酸转氨酶（ALT）和天门冬氨酸转氨酶（AST）等升高。血清白蛋白异常多提示肾脏功能失代偿。在肾脏功能检查中尿液微量白蛋白定量检测，有助于判断和监测肾脏损害程度及预后。发生狼疮肾炎时，血清尿素氮（BUN）及血清肌酐（Cr）有助于判断临床分期和观察治疗效果。系统性红斑狼疮病人存在心血管疾病的高风险性，近年来逐渐引起高度重视。部分系统性红斑狼疮病人存在严重血脂代谢絮乱，炎症指标升高，同时具有高同型半胱氨酸（Hcy）血症。血清脂质水平、超敏C反应蛋白（hs - CRP）和同型半胱氨酸血症被认为是CTD相关动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）有效的预测指标，定期检测可及早发现心血管事件的高危病人。
（4） 自身抗体检测：目前临床开展的系统性红斑狼疮相关自身抗体常规检测项目主要有抗核抗体（ANA）、抗dsDNA抗体、抗ENA抗体（包括抗Sm、抗U1RNP、抗SSA/Ro、抗SSB/La、抗rRNP、抗Scl-70和抗Jo-1等）、抗核小抗体和抗磷脂抗体等。对于临床疑诊系统性红斑狼疮的病人应行自身抗体检测。在美国风湿病学会修订的系统性红斑狼疮分类标准中，免疫学异常和自身抗体阳性包括抗Sm抗体、抗dsDNA抗体、抗磷脂抗体和ANA阳性。
（5）组织病理学检查：皮肤活检和肾活检对于诊断系统性红斑狼疮也有很大的帮助，皮肤狼疮带试阳性和“满堂亮”的肾小球表现均有较高的特异性。


《临床实验室》：在2009年6月期，我们以自身免疫为主题介绍了自身免疫试剂的发展现状和未来发展趋势，这次想请您就
红斑狼疮的疾病诊断详细谈一下自身免疫疾病试剂诊断的现状。
曾小峰教授：自身抗体的检测具有如下临床意义：1. 自身免疫性疾病诊断与鉴别诊断，不同的自身免疫性疾病多具有特征性或疾病相关性自身抗体，对自身免疫性疾病的诊断与鉴别诊断意义重大，对自身免疫性疾病早期诊断、及时治疗至关重要。如系统性红斑狼疮中的抗dsDNA抗体、抗Sm抗体、抗核糖体P蛋白（rRNP）抗体和抗核小体抗体等。2. 自身免疫性疾病病情评估与治疗检测，某些自身抗体与疾病活动性密切相关，通过自身抗体效价与滴度的消长，可判断疾病的活动性，观察治疗反应，指导临床治疗。临床常见的疾病活动性相关自身抗体，如系统性红斑狼疮中的抗ds - DNA抗体，此类自身抗体检测实验室应强调定量、定期检测。3.自身免疫性疾病病程转归与预后判断，某些自身抗体与疾病发展、转归相关。4.自身免疫性疾病致病机制的研究，通过自身抗体临床应用实践，可进一步研究和阐明自身免疫性疾病发病机制。
      系统性红斑狼疮临床常规检测的自身抗体主要包括：抗核抗体（ANA）、抗ds-DNA抗体、抗ENA抗体（包括抗Sm、抗
U1RNP、抗SSA/Ro、抗SSB/La、抗rRNP、抗Scl - 70和抗Jo - 1等）、抗核小体抗体、抗着丝点抗体和抗磷脂抗体等。临床上为了与其他自身免疫性疾病鉴别诊断的需要，还应检测抗中性粒细胞胞浆抗体谱（包括抗PR3抗体和抗MPO抗体）、类风湿因子、类风湿关节炎早期诊断自身抗体谱（抗CCP抗体）、自身免疫性肝病自身抗体谱（抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体等）。分别与系统性血管炎、类风湿关节炎和自身免疫性肝病等疾病相鉴别。
      2004年，为了解我国自身抗体的检测现状，提高现有的检测水平，包括48家医院为参与单位，质控项目包括抗核抗体、抗dsDNA抗体、抗可提取性核抗原（ENA）抗体、抗线粒体抗体和抗平滑肌抗体。标本发放和结果分析采用双盲操作，质控标本共计11份。结果抗核抗体、抗dsDNA抗体、抗ENA抗体、抗线粒体抗体和抗平滑肌抗体正确率分别是47%、70%、46%、95%和40%。
      2006年，以73家医院为参与单位。以双盲法检测抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)、抗双链DNA抗体(抗dsDNA抗体)、抗可提取性核抗原(extractable nuclear antigen，ENA)抗体、抗线粒体抗体(antimitochondrial antibody，AMA)和抗平滑肌抗体(antismooth muscle antibody，ASMA)。结果ANA、抗dsDNA抗体、抗ENA抗体、AMA和ASMA的检测正确率分别是86.2%、75.4%、62.7%、100%和61.1%。可见与2004年的质控相比，各项抗体检测的正确率呈上升趋势，但差异仍然很大，检测的质控需进一步加强。
      上述结果说明我国自身抗体检测的总体情况不容乐观，试剂盒质量参差不齐，检测人员水平不一，缺乏质量管理理念，应从选择好的方法和提高认识水平方面着手改善国内现状。
      现在很多医院的自身抗体检测结果缺乏可比性，没有一个正确的参考标准，就得不出一个正确的结论。而且我们发现很多医院自身抗体检测程序输入错误，因为自身抗体检测方法主要以手工操作为主，影响因素多；检验试剂和检验仪器的准确性和
敏感性以及实验人员经验性都非常重要。自身抗体检测在检验行业里面属于一个比较新的观念，对检测结果，很多实验室给
出的解释与实际病人的临床情况脱节，联系性差，造成了临床的很多误解，对自身抗体检测持怀疑态度。
      针对以上我们在自身免疫诊断试剂方面存在的问题，我们在国家“十一五”科技支撑计划课题中设立了子课题——“建立自身抗体临床检测质量控制体系”，希望能够改进我国的自身抗体检测水平。

《临床实验室》：建立自身抗体检测质量控制体系，应该是一个庞大的工程，您主要从哪几方面来进行这项工程呢？
曾小峰教授：我们现在主要从以下三个方面来进行这项课题：
1.建立示范实验室。我们根据ISO15189及相关质量评定体系，首先进行人员的培训工作，增强质量观念。同时我们进行自身抗体检测试剂的比对，通过大量实验，对已经取得中国SFDA认证的产品进行评测，对比出最优的试剂生产厂家。现在已经有
全国80多家三甲医院的实验室来共同进行这项工作，汇集了同行业的顶尖人才。
2.建立示范企业。自身抗体检测试剂的评估，离不开广大厂家的支持和帮助，现在已经和我们联系并要求进行试剂盒评估的企业在20家以上，我们从中进行大量的测试，计算出各个厂家试剂的稳定性、敏感性和特异性等指标，并进行去伪存真的工作，将优秀的试剂厂家进行推荐使用。在进行试剂盒质量评估的同时，我们联合厂家和参评医院进行室内和室间质控品的研发工作。
3.通过大量的自身抗体检测实验，制定自身抗体检测的的规范程序，并制定相关的质量控制标准。


《临床实验室》：如您上面提到的组织实验室室间自身抗体检测比对工作；建立自身抗体室内质量控制管理体系；研发自身
抗体临床检测室内、室间质量控制品；组织自身抗体检测试剂盒评估；自身免疫病实验诊断技师培训工程、继教计划；制订自身抗体检测质控标准﹑规范程序，您能和我们说下具体的时间安排吗？
曾小峰教授：我们根据研究内容及任务分解，制定了课题研究工作流程，具体执行如下：
      2009年6月，我们已经启动了实验室入题确认。
      2009年7月到9月，我们进行试剂盒检测评估以及比对品的制备工作。
      2009年10月，我们进行第一次自身抗体试剂的检测比对工作。包括对参评实验室试剂的发放、检测﹑回报工作。
      2009年11月，针对参评实验室自身抗体检测比对结果，进行反馈﹑小结，统计分析结果及出现的有关问题。
      2010年6月，总结出现的问题，继续进行自身抗体试剂的检测比对工作。包括对参评实验室试剂的发放、检测﹑回报工作。
      2010年10月，制订自身抗体检测质控标准﹑规范程序以及示范实验室，组织专家研讨会。

《临床实验室》：这次检测的自身抗体都具体包括哪些项目呢？
曾小峰教授：本次自身抗体检测，实验室项目主要包括以下五类20项自身抗体的比较：
ANAs：ANA、anti-dsDNA、anti-ENA
APAs：aCL、anti-β2-GP1
ANCAs：ANCA ANCAs:ANCA、anti-PR3、anti-MPO
RA antibodies：RF、AKA、anti-CCP
AIH/PBC antibodies:AMA/M2、SMA
比对项目：AKA、AP、anti-CCP、antiaCL、ANCA 、AMA/M2、SMA
      此项研究中，自身抗体比对品的朔源性或参考标准为国际标准品或参考品（WHO，NIH）。最终，通过此项研究，我们将通过以下方式制订自身抗体检测质量控制标准及检测规范程序或专家共识：由“十一五”科技支撑计划课题组牵头，邀请“系统性红斑狼疮的临床诊断、综合治疗的研究”专家组、中华医学会风湿病分会、中华医学会检验医学分会、卫生部临床检验中心，同时广泛征求临床﹑检验﹑实验室及企业专家意见，制订自身抗体检测质控标准﹑规范程序以及示范实验室。


《临床实验室》：在整个实验过程当中，为了保证结果的可靠性，都采取了哪些措施来保证标本的有效性？
曾小峰教授：针对自身免疫检测来说，生物标本留取/存储/运输流程如下：
      第一步：血清标本的留取：空腹10～14小时后清晨采静脉血，使用惰性分离胶3-5ml采血管（红头管），样本离心后无溶血、黄疸、乳糜微粒等现象。2-8℃放置不能超过72小时，分离血清采用3000rpm，离心5-15分钟。
      第二步：存储：用6支/3支螺旋冷冻管，低温保存分装，每管标有编号及患者信息，置于-20℃或-80℃冰箱长期保存，避免反复冻熔。
      第三步：运输：密闭、干冰包装，在生物标本运输中，我们需注意：低温、密闭、快速送达；避免剧烈震动﹑避免反复冻
溶；由专门的运输公司负责：入组10例安排转运，48小时内送达北京协和医院风湿免疫科实验室。通过以上方式，我们才能获得合格的生物标本，才能获得良好的研究结果。

《临床实验室》：我们对您的研究非常感兴趣，实验室质量一直是我们杂志再三倡导的主题，这也是我们对您负责的这个课题感兴趣的主要原因，希望能听到您的好消息，到时再请您到我们杂志上来和我们广大读者分享您的科研成果。
曾小峰教授：好的，也谢谢你们！检验与临床真正的结合，才能达到检验结果的有效性。