如何做好人类免疫缺陷病毒抗体的ELISA测定

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人类免疫缺陷病毒抗体（抗-HIV）目前在临床和血站实验室主要的检测方法是酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金或硒试纸条和免疫化学发光法，最常用的是ELISA。ELISA测定现通常为采用手工操作或全自动酶免疫分析仪的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作非常简单，一般涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一环节的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。现分述如下。


一、临床标本的收集和保存

     用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆），有时也用到唾液、尿液等标本。影响抗-HIV ELISA测定的标本因素包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长和标本凝固不全等。
      1．标本溶血 要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。
      2．标本被细菌污染 样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染。一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。
      3．标本贮存时间过长 标本在2~8℃下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性。血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在－70℃以下。
      4．标本凝固不全 血液采集后，如收集管中无促凝剂和抗凝剂，则血液通常在半小时后开始凝固，18~24h完全凝固。日常检验中，常在血液还未开始凝固时即离心分离血清，此时因血液没有完全凝固，离出的“血清”并非为完全的血清，其中仍残留部分纤维蛋白原，如将其加入微孔中，在ELISA测定过程中仍可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果。因此，血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。
      5．冰冻保存标本避免反复冻融 冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。此外，标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。


二、试剂准备

   
    在有些临床实验室，对ELISA测定的试剂准备有时比较随意，较少有其可能会影响实验结果的意识，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来。在室温下放置20分钟以上后再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的37℃，以满足测定要求。所以，实验室应有保证室温在一定范围的措施和设施，如空调。并且这个范围不宜过大，如可以定在23℃±2～3℃。其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液，均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。


三、加血清标本及反应试剂

      
在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器或全自动加样系统加入标本的步骤。使用微量加样器手工加样必须注意的关键点是，加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染，出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要。滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。在使用全自动加样系统加样时，则必须为一次性吸头，反复使用的钢针，则会因为标本之间的交叉污染，而出现假阳性结果，在常规检测中，表现为“拖带”现象。


四、温育

     
  温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。
      温育这一步是临床ELISA测定中最容易出现问题的步骤。通常目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37℃ 30分钟～1小时。一般来说抗原抗体反应在37℃下需要1～2小时才能有较完全的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点：（1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间：一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长；而在临床实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成在实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题；因此，为保证37℃下足够的温育时间，临床实验室可自行确定本实验室不同季节（不同室温下）微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才能达到37℃，从而适当延长板条在温箱中的放置时间；具体的做法是，用一小温度计放置板孔反应溶液中测量观察即可；（2）温育温度的选择：在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一种则为43℃下45分钟；从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时间最为完全，如2～8℃下反应24小时；较高的反
应温度，由于分子运动的加快，反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能；因此，我们建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件；（3）“边缘效应”的排除：以前在使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深，产生这种“边缘效应”的原因可能为96孔板外周孔与中心孔表面或热力学特征的不同，但有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所在。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板孔升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。
      总而言之，在临床ELISA测定中，要保证好的测定效果，可采用下述简单办法来确保温育条件，即尽量采用水浴，温育中让微孔板浮于水面上，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中，这样就会因为板条孔底部直接与37℃水或湿布的接触，以及水浴箱或湿盒内的高温度，而使反应溶液的温度迅速与温室平衡。此外，采用微波或温育时振荡微孔板可提高温育效率或缩短温育时间。


五、洗板

      固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。因此，洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含0.05% Tween20的中性PBS。Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的，但由于抗体或抗原的包被通常也是通过在碱性条件下与固相的疏水性相互作用而被动吸附于固相，因此要注意非离子去垢剂的使用浓度。洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限。在临床实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。手工洗板即是在每次反应温育后，将反应液吸出或甩干，然后在板孔中加满洗液，放置2～3分钟后，将洗液吸出或甩干，再在吸水纸上拍干。重复上述洗涤步骤3～4次，最后在吸水纸上拍干，即可进行下一步测定操作。洗板机洗板则是将上述手工操作改由洗板机进行，使用洗板机洗板的一个特点是，每次洗板后不能拍干，故有较多的液体残留，液体残留量小的洗板机洗板至彻底所需的次数要少于残留量大的洗板机。
      此外，在采用洗板机洗板时，洗板机的日常清洁维护、及时更换洗液和清洁洗液瓶，对于保证洗板质量，避免“花板”非常重要。洗板机每次使用后，如不及时用蒸馏水彻底冲洗管道，则可能因为洗液中磷酸盐缓冲液的残留，一是导致管道堵塞，二是会利于细菌繁殖，导致假阳性结果。洗液更换不及时和洗液瓶清洁不到位，同样会致洗液的细菌污染。

六、显色

       在目前的以HRP作为标记酶的商品抗-HIV1/2 ELISA试剂盒中，均以四甲基联苯胺（TMB）为底物，国产试剂提供的底物为A和B两瓶应用液；某些进口试剂有可能为一瓶。一般商品试剂盒显色反应条件为37℃或室温反应15～30分钟。从理论上说，37℃30分钟才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应25～30分钟后，终止反应比色测定。
      此外，在加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppendorf管中，观察是否有显色出现，如有，则说明底物已变质。以TMB为底物，整个显色反应过程无需避光。显色反应完成后，加入酸终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定或肉眼判断结果。


七、比色

       ELISA的比色测定由酶标仪进行。有的同行可能会认为，既然由酶标仪进行，那么此时便可以万事大吉了。其实不然，因为当代较为先进的酶标仪，均有较多的功能，使用不当，会得到令人难以理解的结果。如使用酶标仪比色测定后，有许多的阴性测定孔的吸光度值为负数或测定假阳性率大大增加等等。这主要是没有正确地理解和使用酶标仪所致。中档以上的酶标仪基本上都同时具有单波长和双波长比色功能。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波长下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非敏感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微孔板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点，一般不必设空白孔（除非空白本身会产生颜色）。如在使用双波长比色时，仍设空白孔，就可能会造成前面提到的测定孔吸光度为负数的现象。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收具有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。

八、结果判定

     临床ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量测定两大类。定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论，分别用“反应性”（reactive）或“阳性反应”和“非反应性”（nonreactive）或“阴性反应”来表示。抗-HIV1/2 ELISA检测为定性测定，检测的目的是判断特定HIV感染的存在与否。ELISA定性测定的“反应性”（reactive）或“阳性反应”和“非反应性”（nonreactive）或“阴性反应”的判定依据是试剂盒所确定的阳性判
定值（Cut-off）。
     下面再解释一下在ELISA定性测定结果判定中常用的一些缩写。（1）S/CO：其中S为Sample（样本）或Specimen（标本）的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为Cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其它ELISA定性测定模式中，当S/CO值大于或等于1时，标本的测定为“阳性反应”，小于1时为“阴性反应”。（2）S/N或P/N：其中S同（1），N为Negative（阴性对照）的简写，P为Patient（患者）的简写。较早的试剂盒很多都使用S/N或P/N≥2.1为阳性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。这种方式与S/CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照（N）的2.1倍视为Cut-off值而已。

九、结果报告及解释

      抗-HIV1/2 ELISA测定结果的报告较为简单，报告“反应性”（reactive）或“阳性反应”和“非反应性”（nonreactive）或“阴性反应”即可。结果的解释比较起来要复杂的多，它要求实验室技术人员对所测定的项目有较为全面的知识基础。抗-HIV 1/2 ELISA检测属于初筛检测，由于我国人群流行率低，加上实际检测操作中的一些问题，抗-HIV1/2检测的阳性预示值可能较低，尤其是弱阳性反应的标本。此外，在特定疾病情况下，如自身免疫病亦会出现较多的假阳性。因此，ELISA检测呈阳性反应的标本必须进一步用蛋白印迹或核酸检测进行确认。此外，阴性反应也不能完全排除HIV感染的存在。现在，检验不再是单纯的实验室测定，而已成为一门临床医学学科，即检验医学，这就要求从事医学检验工作的检验医师，对所做的测定项目除了知其然，还要知其所以然，否则就难免为时代所淘汰。
      综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因，特对常见问题及原因归纳总结于下表。