新型前列腺癌抗原3(PCA3)生物标志物

海风100

前列腺特异性抗原（PSA）在1986年由美国联邦药品监督局批准，已在全球广泛用于诊断和监测前列腺癌症(PCa)。不幸的是，PSA的阳性预测值很低，导致活检阴性的比例很大，常常需要重复PSA测量和活检。血清范围在3-10 ng/mL（灰度区）的男性，活检阴性率接近60-75%。另外，由于没有临床意义的Pca发生率高，以PSA-为基础的机会性筛查可导致Pca诊断增加和过度治疗。此外，进行PSA试验和随后的的活检都会使男性感到焦虑。因此，需要有更好特异性的Pca生物标志物引入到临床实践中。而最有前景的生物标志物就是前列腺癌抗原3（PCA3）。
      什么是PCA3？
      PCA3在1995年 由Johns Hopkins Hospital（Baltimore） 和Radboud University（ Nijmegen, Netherlands）(4)合作研究发现，最初命名为DD3(differential display clone，3）因为使用差别显示分析（在那时是一种新的描述方法，用于识别不同组织中的基因表达）对比正常vs癌变前列腺组织的mRNA表达模式，发现一种mRNA在前列腺癌症中高特异性表达（见图1）。
                                            
      PCA3是非编码信使核糖核酸（mRNA）片段，定位于第9号染色体上(9q21-22)（见图2）。PCA3全长约25kb, 包含4个外显子和3个内含子：1号内含子(20 kb)、2号内含子(873 bp)和3号内含子(227 bp)；4个外显子分别为外显子1、2、3、4。外显子2发生选择性交替拼接，外显子4由4a、4b和4c 3个亚单位选择性多聚腺苷酸化组成。通过RNA印迹(Northern blot)分析可得到3种不同的转录产物(PCA3mRNA)，长度分别为0.6 kb、2 kb和4 kb，其中外显子1、3、4a、4b所组成的cDNA(2 kb)克隆频率出现最高，占60％，是最主要的转录产物；外显子2也是3种转录产物的一部分，但因其发生选择性交替拼接，故转录产物有限，只有5％存在cDNA克隆；外显子4c则仅存在于最大的转录产物(4 kh)中；外显子“出现在两个较大的转录产物中(2 kb和4 kb)。外显子1、3、4a都存在于三种转录产物中。PCA3的三个读取框架交叉的终止密码子的多样性，以及缺乏延伸的开放读取框架，表明PCA3是不编码蛋白质的非编码RNA。最近，发现了PCA3的新基因结构和新的侧面和重叠基因转录产物(如PCA3-TS4同种型)。
      PCA3的前列腺癌特异性
      PCA3在95%的检测的全部前列腺癌中过度表达，可从癌变前列腺细胞中无害测定，准确度接近100%。此外，在前列腺外组织（良性和恶性）中尚未检测到PCA3转录，证明PCA3是目前已知前列腺癌最具特异性的PCa标志物。不像血清PSA，PCA3不受年龄，前列腺体积或其他前列腺病（前列腺炎）的影响。
      BUSSEMAKERS等通过Northern blot法分析正常前列腺、良性前列腺增生和前列腺癌细胞及其转移灶发现，PCA3基因特异性地高表达于人类前列腺癌细胞和转移坏死灶中，在正常前列腺、良性前列腺增生细胞中不表达或低表达。且PCA3 mRNA的表达水平与前列腺癌Gleason病理分级有关。相比之下，在良性和恶性前列腺疾病的患者之间，PSA mRNA水平差异无显著性。BUSSEMAKERS等还发现在正常人，除前列腺外的18种组织器官中均检测不到PCA3基因表达。HES-SELS等还对108例PSA>3 ng/mL的患者行前列腺穿刺活检，用时间分辨荧光定量RT-PCR检测前列腺穿刺活检组织中的PCA3 mRNA，发现PCA3 mRNA在非恶性前列腺组织和良性前列腺增生组织之间差异无显著性。在前列腺癌中，癌细胞数大于10％的前列腺癌标本的PCA3 mRNA拷贝数是非恶性前列腺组织的66倍。癌细胞数少于10％的前列腺癌标本的PCA3 mRNA拷贝数是非恶性前列腺组织的11倍。LANDERS等用实时定量PCR检测前列腺癌组织中的PCA3 mRNA表达，证实前列腺癌组织中DD3是良性前列腺增生组织的140倍。由此可见，PCA3特异性高表达于前列腺癌细胞，在正常前列腺或良性前列腺增生组织中不表达或低表达。因此PCA3适合作为前列腺癌特异性标志物。
      PCA3试验
      PCA3在尿样中测量。尿样采集前应对前列腺进行细致直肠指检（DRE），这样使细胞片状剥落到尿液中。直肠指检对前列腺每侧至少扫三次，紧压（表面压低约1cm）从基部到顶尖，从侧面到中线（见图3）。如果不进行直肠指检，PCA3检测结果有效率仅80%
                                            
                                                                                   图3
      PCA3试验要求采集DRE后第一段20-30ml的排泄尿。约2ml的尿液样本置于运输试管中，试管内装有包含核糖核酸酶抑制剂的溶解缓冲液（如果没有抑制剂，mRNA会在20分钟内破坏）。运输试管在室温（也可冷冻）下连夜送到专门实验室。一些作者使用尿沉渣代替尿样，以检查所有细胞和细胞碎片。但是，最好使用尿样，这样程序更简单。
      已有三代P C A 3试验，市场上可买到试剂盒ProgensaTM PCA3 检测(Gen-Probe, SanDiego, CA, USA) （见图4）。该试剂盒是新型的快速简单的以转录-调停扩增（TMA）为基础的试验，已取代旧的密集型和耗时的逆-转录酶聚合酶链反应试验。TMA-为基础的PCA3检测步骤包括：1）使用包被磁床特异性分离需要的RNA，2）扩增，3）检测和量化分离出的RNA。告知率（产生的准确的可以计量的mRNA用于检测的尿样的百分比）>99%，检测的复现性很好。
      PCA3试验实际上是一种二元检测，分开量化了PCA3与PSA的mRNA转录产物，并测定了二者的比值，即PCA3分数。PCA3分数=(PCA3mRNA)／(PSA mRNA)×1000。
      试验需要量化PSAmRNA以标准化样本中存在的总mRNA。释放到尿液中的前列腺细胞的PSAmRNA水平与血液中的PSA蛋白质水平不相关，实质上在前列腺癌症中不变化。为什么要使用比值呢？因为分母，PSAmRNA表示样本中的前列腺特异性细胞核物质的量。正常前列腺细胞表达的PCA3水平低，如果使用绝对PCA3浓度，在仅富含正常前列腺细胞的样本中可能会得到高分数。因此，PCA3分数表示使用以样本中存在的正常或BPH上皮细胞为背景校正的PCA3表达（图5）。在早期的临床检测中，很快确定尿PCA3分数与前列腺癌的患病可能性正相关（图6）。
                                                            
                                               
      当PCA3分数<5时，活检阳性率为14％；当PCA3分数>100时，活检阳性率为69％；表明PCA3分数与前列腺穿刺活检阳性率正相关。一个前瞻研究中，570名男性进行前列腺活检，PCA3分数为35时癌症的灵敏度和特异性高（分别为54%和74%），所以将临界值确定为PCA3分数=35。
      临床意义
      PCA3试验可能能解决以下PSA困境：1）PSA升高，一个或更多阴性活检结果，2）正常PSA，有前列腺癌家族史，3）正常PSA，活检阳性，4）PSA升高，有前列腺炎，5）PSA升高，PCa前体病变，和6）积极监测微病灶病。潜在临床应用包括检测根治性前列腺切除术或放射疗法后局部复发，和监测服用影响血清PSA的药物（即，5α-还原酶抑制剂）的病人。
      PCA3分数VS PSA检测（图7）
      最近，在其中有2048例首次或重复前列腺穿刺活检者的临床研究的回顾中，PCA3的受试者工作特征(receiver operating
characteristic，ROC)曲线分析，得出ROC曲线下面积(area under the curve，AUC ) 为0 . 6 6 - 0 . 8 7 ， 而P S A 的AUC常常得到更少分数。与PSA的血清水平对比，尿PCA3分数对前列腺癌的特异性更好（66-89%），虽然灵敏度稍低（54-82%）。PCA3的阳性（48%-75%）和阴性（74-90%）预测值则更好。在至少有一个阴性活检的1125个病人的同期群研究中，PCA3经证实（多变量分析）为重复阳性活检的独立预测因素。
      已知血清PSA水平受到BPH组织，年龄，炎症，创伤，以及是否使用5α-还原酶抑制剂的影响，而初步数据表明PCA3分数不受这些因素的影响。例如，标准教学是在直肠指检前采血用于检测PSA水平，因为担心指检会造成血清PSA伪升高。但是，仔细DRE实际上会增加PCA3测定的“告知性”率，事实上是推荐使用的。图8显示了在同一组成人男性中前列腺体积对PSA和PCA3的影响。PSA明显与前列腺体积正相关，而PCA3不是。尽管数据有限，尿PCA3在前列腺癌的早期诊断中表现出特异性优于血清PSA水平。
      PCA3能作为PCa的预后标志物吗？
      几个作者评估了PCA3与前列腺切除术肿瘤体积和其他临床/病理特征之间的相关性。多数研究中，PCA3与肿瘤体积，pT阶段和格里森分数（GS）显著相关。此外，临床显著PCa（肿瘤体积>0.5cc和GS≥7占主导）患者的PCA3显著更高。但是，以前研究中报告的PCA3对PCa恶性进展的预测价值，在近期的其中有70例根治性前列腺切除术者的研究中未得到证实。这是由于使用的是尿沉淀而不是全血样本，还有是因为少数病人预后良好。PCA3的预后值需要在最后实验中验证。
      PCA3被确定为统计学上独立的和告知性新型标志物，能增加多变
量活检模型的预测准确度。估算活检结果预测的预测准确度通过使用有或无PCA3的受试者工作曲线的AUC进行量化。最近，Chun etal. 提出了一个PCA3-为基础的列线图，鉴别有PCa危险的男性，并能帮助确定是否有必要进行进一步评估。PCA3与血清PSA和活检GS结合，预测囊外伸展或临床小体积（<0.5cc）肿瘤的诊断准确度达90%。活检GS为6，低PSA和低PCA3的患者是积极监测的最佳候选人。
      PCA3数据纳入到前列腺癌预防实验（PCPT）风险计算器中很有用。原始PCPT风险计算器包含521例进行前列腺活检者的PCA3， PSA 和DRE数据。更新的PCPT计算器的AUC为0.7，统计上优于无PCA3的原始PCPT计算器的AUC（0.61）。此外，纳入PCA3后改善了灵敏度，阳性和阴性预测值。
      最后，与活检结果为阴性的患者相比，PCa前体病变（前列腺上皮内肿瘤，非典型小腺泡增生）的患者的平均PCA3分数明显更高。接近三分之一的活检阴性和PCA3分数>35的患者有高级的前列腺上皮内肿瘤。

      结 语
      PCA3满足许多PCa生物标志物的要求，在临床实践中有用：1）生物样本取样简便（DRE后尿液），2）方法在检测实验室之间可复现（有可用的商业试剂盒），和3）统计学准确度良好（经研究不同来源人口的几个团队证实）。使用PCA3指导选择重复活检的有效方法是在前列腺活检时采集PCA3样本(“反射PCA3”)。如果活检结果阴性，无需病人返回就能执行 PCA3检测。
      由于PCa是异种病，使用生物标志物板（例如PCA3 和TMPRSS2-ERG基因混合）能进一步改善诊断准确度。挑战仍存在，要确定能有助于在可医治阶段鉴别潜在的威胁生命的PCa。PCA3有可能是这样的预后标志物，但是需要来自相关研究的结果验证。