染色体病是先天性染色体数目异常或结构异常而引起的疾病，同时，也是引起出生缺陷的主要疾病之一。由于染色体上存在上千个基因，染色体发生数目异常，将会导致多个基因的增加或缺失，从而表现为具有多种畸形的综合征，故又称为染色体综合征，这些综合征的临床表现主要包括多发畸形、智力低下和生长发育迟缓等。染色体异常是引起流产和新生儿死亡的最常见原因。染色体综合征分为常染色体异常综合症和性染色体异常综合征，其中，21-三体综合征、18-，13-三体综合征及性染色体异常综合征最为常见，在染色体异常患儿中约占95％。
唐氏综合征(Down’s syndrome)又称21-三体综合征或先天愚型，是最早被人类认识的染色体畸变，也是最常见的常染色体疾病，同时也是引起先天性智力低下的主要原因之一。其发病率占所有染色体疾病的首位，75％会在胎儿期发生流产。由于大部分染色体异常患儿有先天性多发性畸形、特殊面容、生长发育迟缓、智力低下等缺陷，存活者生活完全不能自理，目前尚无有效的治疗方法，给社会、家庭带来了沉重的经济负担和精神负担。因此，产前及时诊断染色体异常儿并终止妊娠，对降低出生缺陷、提高人口素质将发挥十分重要的意义。
新生儿的发生率约为1/600～1/800，占小儿染色体病的70％～80％。据估计我国目前大约有60 万以上的唐氏综合征患儿，每年出生的唐氏综合征患儿可多达27 万例左右，平均每20 分钟就有1 例唐氏综合征患儿出生。其发生率随母亲生育年龄的增高而增高，尤其当母亲年龄大于35 岁时，其生育的子女痴呆儿和畸形儿的发生率明显增高（孕妇年龄与唐氏综合征的发生率的关系见表1）。唐氏综合征的发生起源于卵子或精子在减数分裂过程中染色体的不分离现象，通常是随机发生的，约95％的不分离现象来源于母亲，仅5％左右源于精子发生期。主要是由于产妇年龄过大，卵细胞可发生变化，人体包括卵巢所承受的各种有
害物质和各种射线的影响也就越多，这些因素都会增加遗传物质发生突变的机会，从而导致遗传物质的载体——染色体在细胞分裂过程中发生不分离现象。21 号染色体不分离最为常见，结果导致3 条21 染色体和单条21 号染色体胚胎，几乎所有的单体胚胎和大部分三体胚胎在妊娠早期流产，而仅有小部分的21-三体则会顺利度过妊娠生产，结果出现唐氏综合征。
大量研究资料显示，环境污染及接触有害物质、饮酒、吸烟等均可造成精子、卵子的老化和畸形，是产生唐氏综合征和先天性畸形的重要诱因。
唐氏综合征形成的原因除了5％是由父母遗传外，大部分是随机形成的，其形成原因主要有以下几点：①减数分裂I期发生了染色体的不分离，额外的染色体有15％来自于父亲，大部分唐氏综合征由此原因造成；②染色体不分离发生在受精卵的第一次卵裂期，从而由正常的受精卵形成具有2个细胞系，这是嵌合体形成的主要原因；③4％是由于父母一方是平衡易位的携带者。
由于上述原因导致染色体核型主要表现为3 种型别：①单纯型（标准型）：此型约占全部患者的95％，其染色体核型为47，XX(XY)，+21；②易位型：占4％，增加的一条21 号染色体并不独立存在，而是与D 组(多为D 组14 号染色体)或G 组的一条染色体发生罗伯逊易位，染色体总数为46，其中一条是易位染色体。最常见的是D/G 易位，如核型为46，XX（XY），-14，+t(14q21q)，其次为G/G 易位，如核型为46，XX（XY），-21，+t(21q21q)。③嵌合型：占2.7%，源自合子后早期卵裂时染色体的分离异常。
唐氏综合征的体征非常多样，多个器官组织都有异常，但是，器官组织的发育畸形通常没有严重到危及生命的程度。患者平均寿命只有16.2 岁。50％的患儿在5 岁以前死亡。只有8％的患者超过40 岁，2.6％超过50 岁。目前无特效治疗方法，主要是加强护理，防治各种感染，针对性地进行智力和劳动技能训练，使其能够自食其力地生活。临床表现以智能及体格发育障碍为主。
①特殊面容：为本病的特征性表现。表现为头颅小而圆，脸圆而扁平，鼻梁低平，眼裂小而向上外倾斜，眼距宽，嘴小唇厚，舌大外伸，耳小，耳位低，耳廓畸形。
②智力低下：是本病最突出最严重的表现，智商通常在25％～50％之间；嵌合体型智商多稍高，而标准型及易位型者智商多较低，一般5 岁时智商为50％左右，随年龄的增长智力障碍日渐明显，常缺乏抽象思维能力。
③生长发育迟缓：患儿出生时体重和身高偏低，肌张力低下，以后体格发育、语言发育、动作发育均较同龄小儿落后。
④四肢表现：由于软骨发育差，患者四肢较短，手宽而肥，通贯手，指短，第5 指常内弯、短小或缺小指中节。
⑤多发畸形：50％有先天性心脏畸形，如房、室间隔缺损，动脉导管未闭、法洛四联症等；消化道畸形主要为十二指肠狭窄、食管－气管瘘、肛门闭锁；脐疝、裂唇、裂腭及多指（趾）、并指（趾）等畸形亦较多见。
⑥其他表现：易患呼吸道感染和消化功能障碍，该症患儿白血病的发生率较正常儿高20 倍左右，10％伴有癫痫且多于30 岁左右出现老年性痴呆。
目前，对于唐氏综合征的产前筛查的血清标志物主要有甲胎蛋白（AFP）、游离雌三醇(uE3)、绒毛膜促性腺激素(hCG)、妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A）等。
1.1 甲胎蛋白 AFP是胎儿血清中最常见的球蛋白，其结构和功能类似于白蛋白。早孕期由卵黄囊产生，晚孕期胎儿肝脏大量产生。胎儿上皮完整时，少量的AFP从胎儿泌尿道排入羊水中。非孕妇的血清中可以发现很少量的AFP。孕妇血清中的AFP在早、中孕期逐渐增加，大约在孕28～32周时达到相对稳定期。当胎儿出现开放性神经管缺陷或腹壁缺陷时，羊水和母体血清中的AFP显著升高。
1.2 游离雌三醇 雌三醇是由经胎儿肾上腺和肝脏最后由胎盘合成的一种甾体类激素。它以游离形式直接由胎盘分泌进入母体循环。在母体肝脏内很快地以硫酸盐和葡萄糖苷酸雌三醇的形式代谢。母体血清中uE3水平随着孕周的增长而增加。唐氏综合征胎儿的母体血清uE3偏低，推测可能与胎儿生长迟缓有关。
1.3 绒毛膜促性腺激素 hCG是妇产科医生们所熟悉最常使用的妊娠试验激素。它是由α和β二聚体的糖蛋白组成。α亚单位为垂体前叶激素所共有。β亚单位是hCG所特异的。完整的hCG全部是由胎盘绒毛膜的合体滋养层产生。现认为是由滋养层过渡型细胞和合体细胞产生的。在妊娠的前8周增加很快，以维持妊娠。在大约8周以后，hCG逐渐下降，直到大约20周达到相对稳定。孕妇血清中的hCG主要以完整形式存在，游离β-hCG占总hCG的1％～8％。唐氏综合征时母体血清hCG升高。
1.4 妊娠相关血浆蛋白 PAPP-A是一个大分子蛋白复合物，产生于胎盘。
1.5 抑制素-A 抑制素是一个异二聚体的糖蛋白。β-亚单位与一个βA-亚单位组成抑制素-A；与βB-亚单位组成抑制素-B。血液中以无生物活性的游离亚单位存在。妊娠时母体血清中的大量抑制素被认为来源于胎盘的合体滋养层。早孕时母体血清中不能检出抑制素-B，抑制素-A在孕10～12周时增加并达到高峰，在妊娠中期下降成一个平台，但到妊娠晚期时再一次升高，足月时达最高水平。抑制素-A和hCG一样在胎儿唐氏综合征时升高。抑制素在母体的血清浓度不依赖于hCG的浓度而变化。
超声检查在唐氏综合征产前筛查中占有重要地位。其主要作用有：①各种血清筛查是以孕周为基础，AFP、uE3、hCG和抑制素-A均随孕周的增加而变化，故必须用超声来确认孕周。②由于唐氏综合征胎儿往往伴有宫内生长迟缓和畸形，超声检查可直接发现这些异常。③唐氏综合征还有一些特殊的表现，如张力减退，粗短颈和近端肢体骨短小。研究认为某些异常可早在孕8～14周时发现，如，颈部半透明厚度(nuchal translucency,NT)，胎儿头臀长度(CRL)，脐动脉搏动指数(umbilical artery pulsatilityindex,UAPI)，胎心率等。由于单独血清学筛查或超声检查唐氏综合征检出的阳性率低，因此，联合血清学及超声检查可提高检出率，降低假阳性率。我国目前开展的项目主要是采用多项指标综合筛选的方
法进行分析，如在孕中期，定量检测孕妇血清中AFP、β-hCG、uE3表达的3项联合筛查被称为传统三联筛查实验,是使用最广泛的联合筛查组合，并结合孕周、孕妇年龄等指标，通过专业软件运用统计学方法测算出该孕妇生唐氏综合征患儿的风险率。
染色体核型分析显带技术始于1969年，该方法是沿着整个染色体的长轴，能显现出着色深浅不同。根据显带方法的不同可分为：G显带、Q显带、R显带、K显带等，其中以G显带技术最常用，它主要是预先用热、碱、胰酶、尿素、去污剂或者某些盐溶液处理染色体标本，然后用Giemsa染色显带。染色体核型分析的标本来源包括羊水细胞、绒毛膜组织、外周血细胞等。
由于细胞分裂处于中期时，染色体的长短和大小恰到好处，是研究染色体的最好阶段。因此选择对处于分裂中期的细胞进行染色体核型分析。在外周血中，几乎所有淋巴细胞都是处在G0 期或G1 期， 一般情况下是不分裂的。当在培养液中加入植物血凝素（phytohemagglutinin PHA）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。经过短期培养后，用秋水仙素处理就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察。
染色体核型分析方法虽然经典，可对全部染色体进行分析，但仍然存在以下缺陷：①耗时长，至少需要2周以上的时间；②对实验者要求高，需要一定的经验积累；③操作繁琐，尤其是细胞培养需要无菌操作，否则会因细胞污染导致检测失败；④对异常细胞所占比例小于10％的嵌合体，染色体核型分析无法检出；⑤分析额外染色体来源时，需要同时对父母双方外周血标本进行核型分析；⑥对<4.5Mb的染色体异常无法诊断。
PCR扩增技术应用于染色体数目异常检测始于二十世纪90年代初，目前，针对Down综合征展开的PCR检测，根据扩增DNA序列的不同，主要分为两大类。一类主要是扩增21号染色体上特异的单一靶序列为基础QF-PCR的扩增，另一类是基于扩增21号染色体上特异遗传标记物，即具有遗传多态性的短串联重复序列（small tandem repeats,STR）而进行的定量荧光多重PCR技术检测。
基于QF-PCR技术的检测主要是通过选择21号染色体上特定序列作为扩增靶序列进行PCR扩增，通过测定扩增产物量从而确定细胞中存在这一特定染色体的数目。细胞遗传学研究表明，唐氏综合征异常体征的产生主要是由于21q22.1和21q22.2的异常复制所导致的。而21q22区域对产生典型的唐氏综合征面部特征是非常重要的，缺乏21q22的21号染色体部分三体则不表现唐氏综合征的典型特征。因此，该区域称为唐氏综合征核心区(Down SyndromeCritical Region,DSCR)。目前QF-PCR扩增的靶点，多数是在核心区选择特定的靶基因，如DSCR3、DSCR4基因等的部分片段作为扩增目的基因。通过使用相对定量法进行定量检测，同
时，选择在其他染色体（如1号染色体）上不易发生缺失或三体的区域的部分片段作为内参照分子标记。应用Taqman探针原理方法，采用多重实时定量PCR技术于同一反应管内对目的序列同时进行扩增检测，通过反映相对量的delta CT值来确定21号染色体的数目，并由此诊断唐氏综合征。近年来，结合核型分析的STR-PCR技术试验性地用于检测已知样本或产前未知样本的染色体情况。
另一类是基于扩增21号染色体上特异遗传标记物，即具有遗传多态性的STR而进行的定量荧光多重PCR技术检测。STR，又称微卫星序列（microsatellite DNA），它是指重复单位长度为2～6个核苷酸的串联重复序列，广泛分布于人类基因组内，平均每20 kb就出现1个STR位点，最常见的是以二聚核苷酸为重复单位，被称为人类第二类遗传标记。由于串联重复的数目不同，在不同的个体之间呈现高度多态性，因此是人类定量检测染色体数目异常最有力的遗传标记。相对于正常人，患者的体细胞会出现所含染色体数目的增加或减少，因此染色体上相应的STR位点的量也会随之增加或减少，通过对这些STR位点进行扩增，用银染
或者荧光标记的方法即可根据PCR产物的量推断染色体量的改变。
定量荧光多重PCR技术是指对同一模板应用一对以上的荧光标记引物同时扩增不同区域，PCR扩增后应用凝胶电泳分离PCR产物，对产物的荧光检测以获得染色体数目变化情况的一种检测方法。STR-PCR技术在检测唐氏综合征上，主要是通过选取21号染色体上特异的STR遗传位点，引物用荧光标记，PCR扩增后通过凝胶电泳分析，结果分析借助于毛细管凝胶电泳装置【目前最常用的是ABI PRISM(r) 310或者ABI PRISM(r) 3100遗传分析仪】，经过生物应用软件对结果进行分析判断（图1）。在应用STR-PCR扩增靶序列时，需要同时选择21号染色体上杂合率高、特异性强的几个STR位点，进行荧光定量多重PCR扩增，从而可以减少纯合子出现的概率，使检测的精确度提高，在欧洲多个临床分子遗传实验室得到了广泛的应用。
传统的染色体核型分析技术从细胞培养到报告结果至少需要2周的时间，而本STR-PCR检测在24小时内即可发送报告，检测周期明显缩短，并且可以避免培养过程中污染事件的发生；所需样本量少，仅仅需要少许样本就可以进行检测；从PCR扩增到最终的结果分析均可自动化，适于大规模检测，可以减少人为因素的干扰。但是，该技术不能对染色体结构异常进行分析。因此，将STR-PCR方法与传统细胞遗传学方法相结合，发挥各自优势，是产前诊断技术发展的趋势。
FISH 是综合细胞遗传学、分子生物学及免疫学技术的的一项新技术。主要是利用已知碱基序列的非同位素标记的核酸探针，依据碱基互补配对原理，通过荧光亲和素免疫组化检测体系，在组织切片、细胞间期核及染色体等标本上，对待测核酸进行定性、定位及相对定量分析的一种方法。可检测到一些微小的染色体易位。它能用直接标记的21 号染色体特异位点DNA 探针，观察间期细胞中21 号染色体的畸变情况。荧光探针可与间期细胞中目的染色体特异性结合并发出荧光，在荧光显微镜下表现为荧光斑点，染色体数目理论上与荧光斑点数存在一一对应的关系。正常人来源的细胞标本，镜下显示为2 个斑点，三倍体患者来源的细胞标本，镜下则为3 个斑点（图2）。通过对荧光斑点的计数即可对染色体数目进行判断。由于染色体在间期细胞中定位于一定区域，因此无需细胞培养即可对间期细胞进行诊断。这样大大缩短了检测周期。
FISH 与传统染色体核型分析方法比较，耗时少，仅需24 小时左右；操作相对简单，无需细胞培养；所需费用低于染色体核型分析；其灵敏度、特异度相对较高。与QF-PCR 相比，FISH 所需标本量大；操作过程不利于自动化，费用相对昂贵；这些均不能满足大规模检测的需要。技术上由于探针设计是针对着丝粒区域的重复序列设计，因此对染色体短臂丢失、断裂及着丝粒融合导致的易位型无法检测出来，而且间期染色体分布弥散，必将导致荧光信号弥散，从而影响结果的判定。尤其对微小标记染色体、染色体的微小相互易位具有高度的敏感性和可靠性。间期FISH 只能检出染色体的数目异常，而对于结构异常，则无法进行诊
断，由于间期FISH 具有快速简便和准确性高等特点，作为传统的细胞遗传学诊断的辅助手段，是具有很好的临床应用价值的，在实际临床实践中，应对该方法的性质、适用范围和优缺点有明确的了解，根据实际情况，并且在患者知情同意的前提下，来进行间期FISH 分析。综上所述，唐氏综合征作为最常见的常染色体疾病，引起先天性智力低下的主要原因之一，已经成为影响我国国民经济发展和出生人口素质的重要因素之一。由于该疾病目前未找到有效的治疗方法，临床上多采取遗传咨询、预防为主。因此，通过在目标人群中及时有效地开展产前筛查和产前诊断，是预防出生缺陷有效的手段和措施。将传统的细胞遗传学方法
和新兴的分子遗传学方法有效的结合起来，才能在妊娠发展的各个阶段进行及时、准确的产前筛查和产前诊断，从真正意义上做到降低我国出生缺陷发生率的目标。
综上所述，唐氏综合征作为最常见的常染色体疾病，引起先天性智力低下的主要原因之一，已经成为影响我国国民经济发展和出生人口素质的重要因素之一。由于该疾病目前未找到有效的治疗方法，临床上多采取遗传咨询、预防为主。因此，通过在目标人群中及时有效地开展产前筛查和产前诊断，是预防出生缺陷有效的手段和措施。将传统的细胞遗传学方法和新兴的分子遗传学方法有效的结合起来，才能在妊娠发展的各个阶段进行及时、准确的产前筛查和产前诊断，从真正意义上做到降低我国出生缺陷发生率的目标。 | 
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发表于 2017-3-16 01:09:03
