奇异变形杆菌周期性群集运动的研究

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                                                                第三军医大学医学检验系生物研究中心     贾雄飞,刘俊康,徐启旺
       提　要: 目的　研究奇异变形杆菌(proteus mirabilis , PM) 迁徙生长过程中形态、数量、呼吸酶活性等指标周期性变化。方法　在培养基中加入2 ,3 ,5 - 三苯基四唑氯化物(2 ,3 ,52tetraphenyltetrazolium chloride , TTC) 作为呼吸酶活性的指示剂观察细菌呼吸酶活性的变化。采用透射电子显微镜对细菌形态、鞭毛进行对比观察。比浊法计数PM 在时间、空间上的数量的变化。结果　PM 在固体培养基迁徙生长过程中出现菌体数量逐渐减少、形态由短小到细长、鞭毛由少变多、呼吸酶从有活性向无活性转变的周期性变化。结论　PM 在培养基迁徙生长过程中,微观上出现菌体长度、鞭毛数量、细菌密度等周期性变化,宏观上出现水波样的环状运动,这是环境、鞭毛、细胞间信号传递和细菌密度等多因素联合作用的结果。
       关键词: 奇异变形杆菌;群集运动;鞭毛;迁徙生长

       在许多病原菌和宿主相互作用过程中细菌的泳动能力起到重要的作用1 ,一些病原菌同时还具有多细胞的群集迁移能力。研究表明变形杆菌群集运动能力有助于其在泌尿道的定植2 也可能与尿导管上生物膜的形成有关3 。奇异变形杆菌分化成高鞭毛密度的群集体细胞后,除了能使群集体快速迁移,还能促进细菌对宿主细胞的入侵能力。目前对于变形杆菌迁徙能力的认识主要侧重于对鞭毛的研究。本实验以奇异变形杆菌为对象,结合生物波理论对运动活泼具有潜在生长能力的细菌潜生体(cryptic growth cell , CGC) ,和运动能力弱或无、生长繁殖力旺盛繁的繁殖体(vegetative cell , VC) 的研究4 ,5 来观察PM 迁徙生长过程中菌体形态、鞭毛数量、呼吸酶活性的变化,进一步阐述变形杆菌的周期性群集运动机制。
1 材料与方法
1. 1 实验菌株和培养基
       奇异变形杆菌(proteus mirabilis , PM) 由本实验室保存LB培养基(1%胰胨,0.5 %酵母提取物,1 % NaCl ,pH 7.2) ;普通营养琼脂培养基(1 %蛋白胨, 0.3 %牛肉膏,0.5 % NaCl) 。
1. 2 TTC 指示剂培养观察
       将已经高压灭菌的LB 培养基溶化后待其温度降至50 ℃左右按比例加入TTC 混匀使其终浓度为0.5 ‰。中心点种奇异变形杆菌37 ℃过夜培养。
1. 3 电子显微镜观察
       将奇异变形杆菌接种于LB 培养基在37 ℃恒温过夜培养(12 h) 。用接种环从最外环和红环刮取少许细菌,分别在装有1 ml 无菌生理盐水EP 管中制成菌悬液。将包被有聚乙烯醇缩甲醛的铜网放于菌液中5 min ,使细菌附着于铜网上。取出铜网用磷钨酸负染10 min ,放干。在PHIL IPS TECNAI10 透射电子显微镜下观察。
2 结果
2. 1 奇异变形杆菌在TTC 指示剂培养基培养观察结果
       在含有TTC 的LB 培养基中心点种PM ,8 h 后即形成中心菌落,此后在光镜下观察,每过3 h 可出现新的红色环状菌落,黄环区域位于红环之间,为未显色菌落(图1) 。红环是TTC 被呼吸酶还原的结果,清楚地显示了奇异变形杆菌在迁徙生长过程中呼吸酶活性的周期性变化,表现为红黄相间的同心环状,红环表示变形杆菌呼吸酶活性正常,不显红色区域反之。

图1 TTC指示剂培养观察结果

2. 2 培养的奇异变形杆菌透射电子显微镜观察结果
       在电镜下可见不显红色区域的PM 形态均为细长杆状长度一般超过8μm ,菌体上附着大量的鞭毛的CGC(图2A ,B) ;红环边缘处为正在断裂繁殖的CGC(图2C) ;红环上的PM形态大多为球杆状的VC 长度为015～8 nm ,鞭毛显著减少,有些菌体鞭毛缺失(图2D) 。

图2 奇异变形杆潜生体和繁殖体

3 讨论
       本次实验以细菌群集运动过程中奇异变形杆菌为对象,对其在平板上的迁徙生长现象进行了的研究,发现PM 在周期波动生长过程中,菌体形态、鞭毛的多少、呼吸酶活性和细菌密度的变化也存在周期性的同步变化。VC 在固体培养基由于各种因素的作用分化成运动活泼、菌体细长、鞭毛高度表达,菌体沿其长轴方向有序排列的CGC(图2B) ,但其有氧呼吸活动是在一定程度上是被抑制,这说明CGC 在形态、表面分化、代谢产能方面也与VC 有很明显的不同,而且这种变化是周期性的。在有TTC 作为呼吸酶指示剂的平板上培养的PM 菌落不显红色的区域对应的是CGC 扩散的阶段,而红色区域则对应CGC 去分化后进行断裂繁殖的阶段。
       目前研究表明,鞭毛表达的转录活化因子FlhD/FlhC 会抑制有氧呼吸中的酶活性6 ,flhDC 在表达上非常小的变化都会对群集细胞的生长发育产生很大影响7 ,这就可以解释为什么奇异变形杆出现菌体在培养基不同区域集体性变长或变短、鞭毛变多或变少甚至消失、细菌的密度也发生增多和减少的周期性变化8 。以TTC 作为有氧呼吸的活动变化的指示剂,出现有趣的水波纹样的同心环状的周期波动现象,也在宏观上有力的支持了上述研究结果。因此变形杆菌作为致病菌,其CGC 多细胞迁移能力是对于泌尿道的定植致病性的重要因素9。
       可以说奇异变形杆菌在LB 培养基迁徙生长过程中从微观的菌体长度、鞭毛数量、细菌密度等周期性变化,到宏观上的出现的水波样的环状运动,是包括环境,细胞间的信号传递,细菌密度,flhDC 操纵子等多因素联合作用的结果。
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                                                                                                                                            编辑：范伟伟