亚胺培南对肺炎克雷伯菌抑菌圈直径与KPC型碳青霉烯酶检测

钮留

                                               赵建萍1, 黄金伟1 , 陈丽珠1, 李爱芳1, 黄建胜1, 王晓光2, 陈秀英2, 李国雄1
                                              1. 浙江省丽水市中心医院检验科; 2. 浙江省丽水市疾病预防控制中心
       [ 摘要] 目的: 探讨临床分离的肺炎克雷伯菌的亚胺培南抑菌圈直径大小与KPC 型碳青霉烯酶( Carbapenem aseKPC)存在的相关性。方法: 利用ESBLs 确认试验对临床分离的肺炎克雷伯菌产ESBLs 检测, 并分为ESBLs 阳性组与ESBLs 阴性组, K- B 法检测亚胺培南对所有菌抑菌圈直径, PCR方法检测所有菌KPC。结果: 亚胺培南对81株肺炎克雷伯菌ESBLs 阳性组抑菌圈直径27.92 ± 0.18 cm, 统计学方法推论95%抑菌圈范围27.10~ 28.48 cm; ESBLs 阴性组101株抑菌圈直径28.28 ± 0.11 cm, 统计学方法推论95%抑菌圈范围27.40~ 28.86 cm, 2组抑菌环直径比较无明显差异( P > 0.05) 。2株ESBLs 阳性肺炎克雷伯菌亚胺培南抑菌圈直径分别为20 cm 和19.5 cm, 同时检测到KPC。结论: 亚胺培南对临床分离的肺炎克雷伯菌抑菌圈直径小于或等于20 cm, 该菌检测到KPC型碳青霉烯酶可能是原因之一。
       [ 关键词] 克雷伯菌; 肺炎; 亚胺培南; KPC

       肺炎克雷伯菌是医院感染的常见病原菌, 其耐药的主要原因是细菌产生质粒介导的β内酰胺酶, 主要是超广谱酶和AmpC 酶, 有时两种同时存在, 造成对多种抗菌药物耐药[1] 。但是碳青霉烯类抗生素对超广谱酶和AmpC 酶高度稳定, 临床应用于治疗产超广谱酶和或AmpC 酶肺炎克雷伯菌感染有良好的效果, 随着碳青霉烯类抗生素的大量使用, 对其耐药的肺炎克雷伯菌检出明显增多。研究发现肺炎克雷伯菌产生一种质粒编码能被克拉维酸抑制的A 类碳青霉烯酶KPC是重要原因[ 2~ 4] 。临床上KPC的检测主要依靠于PCR方法, 但是临床操作繁琐, 不适合常规开展, 如果从肺炎克雷伯菌耐药表型推测细菌产KPC可能性, 方法易行, 将对临床上KPC 的检测有重要意义。本文就亚胺培南对肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径大小与KPC存在的相关性做一探讨, 报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
       1.1.1 菌株来源 取自我院微生物实验室2008 年1 月~2008年12月期间的临床分离肺炎克雷伯菌126株(同一患者无重复分离株) , 菌株标本主要来源: 痰、尿液、血液等。
       1.1.2 主要的仪器与试剂 法国生物梅里埃Vitek- compact全自动细菌分析鉴定系统。亚胺培南药敏纸片、药敏M - H培养基购自英国OXOID 公司。PCR 仪为PE 公司产品; PhastSy stem 电泳仪为瑞典Pharmacia Biotech 公司产品; Taq酶, PCR产物纯化、凝胶回收试剂盒及blakpc F: 5’- CTG GAG GAC TAT GAC TTC- 3’,R: 5- ATA CCA CCC TGA CAG CCG- 3均为上海赛百盛公司产品, 质控菌株: ATCC25922 ( 大肠杆菌)、ATCC25923 ( 金黄色葡萄球菌)、ATCC27853 ( 铜绿假单孢菌)。
       1.2 方法
       1.2.1 菌株分离与鉴定 按常规方法从各种临床标本分离细菌, 获纯培养后进行革兰染色和氧化酶试验, 根据革兰染色和氧化酶结果选择革兰阴性鉴定卡在全自动微生物分析仪上进行菌种鉴定, 严格按照操作说明进行操作。
       1.2.2 ESBLs检测[ 5]  将菌株用头孢他啶( 30 ug )、头孢他啶+ 棒酸( 30 /10 ug ) 及头孢噻肟( 30 ug )、头孢噻肟+ 棒酸( 30 /10 ug )纸片做药敏试验, 含棒酸的和不含棒酸的纸片抑菌圈直径相差大于5 mm 可判定为阳性。
       1.2.3 亚胺培南敏感性试验 采用K- B 法对亚胺培南进行药敏试验, 按照CLSI规定的操作规程进行操作[ 5]。量取亚胺培南对所有菌抑菌圈直径并记录, 推测95%抑菌圈直径范围。
       1.2.4 模板制备与PCR扩增及测序 采用煮沸裂解法制备模板DNA。PCR 筛选KPC 基因所用引物参照文献。以大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603 作阴性对照,以余方友博士赠送的KPC - 2阳性肺炎克雷伯菌菌株作阳性对照。
2 结果
       2.1 亚胺培南对肺炎克雷伯菌敏感性试验结果亚胺培南对81株肺炎克雷伯菌ESBLs 阳性组抑菌圈直径27.92 ± 0.18 cm, 统计学方法推论95%抑菌圈范围27.10~28.48 cm, 最小的抑菌圈直径为23.0 cm ( 除外2株ESBLs 阳性肺炎克雷伯菌亚胺培南抑菌圈直径分别为20 cm 和19.5 cm ); ESBLs 阴性组101株抑菌圈直径28.28 ± 0.11 cm,统计学方法推论95%抑菌圈范围27.40~ 28.86 cm, 最小的抑菌圈直径为23.5 cm, 见表1。

       2.2 PCR产物电泳图
       对192株细菌利用PCR 扩增KPC, 其中2 株亚胺培南抑菌圈直径分别为20 cm、19.5 cm 的肺炎克雷伯菌的为阳性(目标条带: 448 bp)。PCR 产物电泳结果详细见图1。

3 讨论
       随着碳青霉烯类抗生素在临床上使用增加, 耐药菌株也增加。尤其近几年在肠杆菌属细菌发现产KPC的耐药菌并不少见, 包括肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌、沙门菌[ 3, 4, 6] 。肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗生素的主要机理有细菌产AmpC 酶合并外膜孔蛋白的丢失、金属酶、OXA酶和KPC β内酰胺酶等, 尤其是产KPC 酶的菌株, KPC酶属于Bush分类法中的A 类2f 组, 克拉维酸对酶活性有抑制作用[1, 7, 8] 。KPC 型B内酰胺酶目前已有4种亚型, 包括KPC- 1至KPC- 6, 它们之间只有个别氨基酸发生了突变。国外报道产KPCB内酰胺酶的菌株既可表现为对碳青霉烯类抗生素耐药也可表现为中介或敏感, 并存在接种效应, 这增加对其识别难度[4] 。
       本研究中发现, 亚胺培南对ESBLs 阴性组的肺炎克雷伯菌抑菌圈直径和ESBLs阳性组细菌抑菌圈直径比较, 虽然前者有大于后者倾向, 但无统计学意义。CLSI 认为亚胺培南对肺炎克雷伯菌抑菌圈直径大于16 就判定为敏感, 在本研究中190株肺炎克雷伯菌抑菌圈直径均大于等于23 cm, 与CLSI 标准有较大差距, 具体原因有待进一步研究。即使2 株亚胺培南抑菌圈直径分别为20, 19.5 cm, 按照CLSI 标准仍然判定为敏感, 但经PCR 的检测均发现携带KPC酶, 并且这2株细菌均是ESBLs 检测阳性, 符合KPC 酶的特点。我们得出如果亚胺培南对肺炎克雷伯菌抑菌圈直径在16~ 20 cm 之间有可能产KPC 酶, 临床上检测时要注意。目前, 因为产KPC 酶肺炎克雷伯菌还没有大规模的流行, 本次研究的KPC 酶阳性菌过少, 以亚胺培南对肺炎克雷伯菌抑菌圈直径具体范围与菌株产KPC酶相关性, 需要更多临床分离株验证。
       近几年, 国内报告产KPC 酶肺炎克雷伯菌增多, 而在美国, 特别在美国东北部各州蔓延, 在局部造成暴发流行, 如何利用表型特征更快更准确检测KPC 酶对于流行病学调查, 控制耐药基因传播, 指导临床合理用药有重要的意义, 也成为研究热点之一。除了本研究利用亚胺培南抑菌圈直径来推测KPC 酶, 并用分子生物学方法来确认外, A thanassios Tsakris 等[10]用硼酸琼脂扩散试验检测KPC 酶, 特异性与敏感性均很高。M usaH indiyeh等[11] 应用实时荧光定量PCR 检测KPC 酶也具有良好的效果。对于产KPC 酶, 但K - B法判定为敏感的细菌, 临床上是否可以继续应用碳青霉烯类抗生素, 或者加大碳青霉烯类抗生素剂量治疗仍然存在争议, 而对于此类细菌继续应用碳青霉烯类抗生素是否增加耐药性有待于进一步研究。
                                                                                                                                    编辑：范伟伟