肺炎克雷伯菌的分布与药敏性分析

晨曦

                                                                                                                  陈国英1，陈建江2，娄晓寅2
                                                1．浙江绍兴文理学院附属医院肿瘤科；2．浙江省绍兴县中心医院检验科
       摘要：目的　统计２００９－２０１０年肺炎克雷伯菌的分布、药敏性及流行状况，指导临床用药，控制医院感染。方法  对２０１０年分离出肺炎克雷伯菌的１６２例住院患者进行标本、科室分布的统计及药敏分析；对其中多药耐药肺炎克雷伯菌作ＥＳＢＬｓ、ＡｍｐＣ酶、碳青霉烯酶、新德里金属β－内酰胺酶（ＮＤＭ）－１等试验。结果　１６２株肺炎克雷伯菌主要来自痰液，占７６．５４％，其次为尿液及伤口分泌物，分别占８．６４％、６．７９％；主要分布于ＩＣＵ、呼吸内科，分别占５１．２３％、２２．８４％；产ＥＳＢＬｓ肺炎克雷伯菌检出８４株，检出率为５１．８５％，产ＡｍｐＣ酶检出２０株，检出率为１２．３５％，产ＫＰＣ酶检出１７株，检出率为１０．４９％，没有检测到产新德里金属β－内酰胺酶（ＮＤＭ）－１菌株。结论　肺炎克雷伯菌耐药率比较高并且耐药因子多样，对多药耐药肺炎克雷伯菌有必要进行耐药机制的检测，以便控制医院感染。
       关键词：多药耐药肺炎克雷伯菌；药敏试验；感染

       肺炎克雷伯是医院感染的重要条件致病菌，随着各类广谱抗菌药物、激素及免疫抑制剂的广泛应用，出现了大量以产ＥＳＢＬｓ为主的多药耐药肠杆菌科细菌。临床上碳青酶烯类抗菌药物被认为是治疗产ＥＳＢＬｓ肠杆菌科细菌感染的特效药。近年来，肠杆菌科细菌产碳青酶烯酶在国内外报道越来越多，特别表现在产ＥＳＢＬｓ、产ＡｍｐＣ 酶、产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的临床分离菌株。笔者对我院分离的多药耐药肺炎克雷伯菌作进一步耐药分析，以便临床合理用药及控制多药耐药肺炎克雷伯菌的扩散和传播。
１材料与方法
       １．１菌株来源　２００９－２０１０年我院１６２例门诊和住院患者临床标本中分离的肺炎克雷伯菌。
       １．２仪器与试剂　Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ　ＡＳ－４微生物分析仪，ＶＩＴＥＫ－２ 麦氏比浊仪，ＥＳＢＬｓ检测试剂盒、Ｍ－Ｈ琼脂购自杭州天和公司，Ｏｘｏｉｄ药敏纸片，三洋低温冰箱ＭＤＦ－３８２Ｅ，台式高速离心机ＬＧ１６－Ｗ。
       １．３方法
       １．３．１ＥＳＢＬｓ检测　仪器检测阳性的菌株用ＥＳＢＬｓ检测试剂盒确诊。严格按照说明书要求操作。
       １．３．２碳青霉烯酶表型筛查试　采用Ｋ－Ｂ法，根据ＣＬＳＩ（２０１０年版）标准，美罗培南（１０μｇ）或亚胺培南（１０μｇ）抑菌圈直径≤２２ｍｍ，为表型筛查阳性。
       １．３．３产ＮＤＭ－１表型确诊试验　双纸片协同试验采用美罗培南（１０μｇ）或亚胺培南（１０μｇ）、ＥＤＴＡ（１５００μｇ）两种纸片进行Ｋ－Ｂ法，两纸片距离１０～１５ｍｍ，在含ＥＤＴＡ纸片方向处，美罗培南或亚胺培南抑菌圈扩大，即可判定产金属酶。组合纸片法采用美罗培南（１０μｇ）或亚胺培南（１０μｇ）／ＥＤＴＡ复合纸片进行Ｋ－Ｂ法药敏试验，复合纸片比单药纸片的抑菌圈直径增大值为≥５ｍｍ，送浙一传染病重点实验室进行检测。
       １．３．４改良霍奇试验（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｈｏｄｇｅ　ｔｅｓｔ）　制备０．５麦氏浊度单位的大肠埃希菌ＡＴＣＣ　２５９２２菌悬液，１∶１０稀释备用。用棉签均匀涂布Ｍ－Ｈ 平皿，约５ｍｉｎ，中心贴美罗培南（１０μｇ纸片）。用１μｌ接种环挑取２～３个菌落，从纸片边缘向外划线。过夜培养（１６～２０ｈ）。出现向内生长的菌株是碳青酶烯酶阳性。
       １．３．５ＡｍｐＣ酶表型筛选及确认试验　采用琼脂扩散法（Ｋ－Ｂ法），用头孢西丁（ＦＯＸ）纸片检测临床分离菌株。抑菌圈直径≤１８ｍｍ提示对ＦＯＸ耐药或中介疑为产ＡｍｐＣ酶菌株。即为ＡｍｐＣ酶表型筛选阳性。三维确认试验是粗酶提取物ＦＯＸ三维试验方法，粗酶提取采用反复冻融法。
       １．３．６质控菌株　大肠埃希菌ＡＴＣＣ　２５９２２、肺炎克雷伯菌ＡＴＣＣ　７００６０３。
       １．４统计方法　用ＳＰＳＳ１１．５进行统计分析。
２结　果
       ２．１标本分布　１６２株肺炎克雷伯菌株主要分离自痰液，其次是尿液和伤口分泌物中。见表１。

       ２．２科室分布　１６２例患者分离的肺炎克雷伯菌株主要分布在ＩＣＵ 和呼吸内科中，达到７４．０７％。见表２。

       ２．３药敏试验比较　分离的１６２株肺炎克雷伯菌中，产ＥＳＢＬｓ肺炎克雷伯菌８４株，检出率为５１．８５％，其耐药率与非产ＥＳＢＬｓ肺炎克雷伯菌耐药率差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。产与非产ＥＳＢＬｓ肺炎克雷伯菌的药敏率见表３。

       ２．４耐药因子分析　本组１６２株肺炎克雷伯菌中产ＥＳＢＬｓ检出率为５１．８５％；产ＡｍｐＣ酶２０株，检出率为１２．３５％；产ＫＰＣ酶１７株，检出率为１０．４９％；未检测到产新德里金属β－内酰胺酶（ＮＤＭ）－１菌。见表４。

３讨　论
        第三代头孢菌素被临床广泛应用的今天，高产ＡｍｐＣ酶、产ＥＳＢＬｓ的革兰阴性杆菌不断增加。亚胺培南等碳青霉烯类药物就被广泛应用到临床，产ＫＰＣ酶的肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌、弗氏柠檬酸杆菌等不断出现，产ＮＤＭ－１的肺炎克雷伯菌也被发现。临床已面临着多药耐药或全耐药的革兰阴性杆菌在全球流行，以引起了国内外卫生组织的高度重视。
       我院２００８－２０１０年产ＥＳＢＬｓ肺炎克雷伯菌的分离率呈不断增高趋势，２０１０年分离到产碳青霉烯类肺炎克雷伯菌１７株，并且集中在３－６月份，形成小规模的流行。ＩＣＵ和呼吸内科是多药耐药肺炎克雷伯菌重灾区，在痰液标本中检出率为最高，这与ＩＣＵ和呼吸内科广泛使用三代头孢菌素或亚胺培南／西司他丁有很大关系。虽未检测到产ＮＤＭ－１的肺炎克雷伯菌，但也应引起临床和实验室的高度重视。
       药敏结果显示，产与非产ＥＳＢＬｓ肺炎克雷伯菌耐药性有明显差异。喹诺酮类和氨基糖苷类药物也在产ＥＳＢＬｓ肺炎克雷伯菌中有较高的耐药性。对含酶抑制剂的复合抗菌药物在产ＥＳＢＬｓ肺炎克雷伯菌菌株中，氨苄西林／舒巴坦几乎全耐药，哌拉西林／他唑巴坦也有２２．６％。本组产ＡｍｐＣ酶２０株，检出率为１２．３５％，其中ＥＳＢＬｓ＋ ＡＭＰＣ　８株，这直接影响了用含酶抑制剂的复合抗菌药物对产ＥＳＢＬｓ肺炎克雷伯菌菌株的疗效。临床常直接用亚胺培南／西司他丁等碳青霉烯类药物来治疗产ＥＳＢＬｓ肺炎克雷伯菌感染的患者。
       实验室应建立快速检测ＥＳＢＬｓ、ＡｍｐＣ酶、金属酶和产碳青霉烯酶的简易方法，对临床合理使用抗菌药物有更直接、有效的证据。也可作流行病调查，控制医院感染。用改良霍奇试验证实是否产碳青霉烯酶，其灵敏度和特异性均为１００．００％。本组在分离到产碳青酶烯类肺炎克雷伯菌的菌株，用改良霍奇试验进行阳性确定。临床采用隔离消毒、严格医护人员的手消毒等措施，感染得到了控制。
       因此，实验室在耐药因子筛选的表型检测中，要不断摸索、总结经验。不要随便放过临床耐药菌株表象，深入研究和加以分析，找出抗菌药物耐药特性，以便控制感染。
                                                                                                                                    编辑：范伟伟