血清抗体早期诊断侵袭性念珠菌病的研究进展

姑姑机

                                                                        白求恩国际和平医院检验实验中心     侯天文 陈兴 白云
       【摘要】近年来，研究者已经评价的大量具有潜在诊断价值标志物，尤其是应用念珠菌特异性抗原的血清抗体早期诊断侵袭性念珠菌病有了长足进展。如HWP1、EN01等IgG抗体的单个或多个组合快速准确地诊断早期念珠菌病，不仅适用于免疫正常患者，而且适用于免疫受损患者，因此，在临床上具有潜在的巨大的应用价值。
       【关键词】侵袭性念珠菌病；抗体；IgG；早期诊断；HWP1 抗体

       侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)包括一类广泛的严重和侵袭性疾病：念珠菌血症，播散性念珠菌病、心内膜炎、脑膜炎、眼内炎和其他深部器官侵袭；除外特表浅和轻微的疾病，如口咽和食道念珠菌病[1]。诊断IC 是困难的，因为感染和定植问没有特异性的临床指征可以区分。在最近十年里，研究者已经评价的大量具有潜在诊断价值标志物，包括念珠菌核酸检测，代谢产物如D-阿拉伯糖醇，细胞壁成分如β-葡聚糖(BG)[2]，抗原如分泌型天冬氨酸蛋白酶(SAP)，烯醇化酶(ENOI)，甘露聚糖等。尽管每种试验各有其诊断价值，但无一种试验被临床广泛确证和接受[3]。以往对抗体检测作为诊断策略缺乏热情，可能是顾虑在免疫受损患者抗体可能假阴性。然而，最近检测抗体的研究，如抗SAP、ENO1、甘露聚糖、菌丝壁蛋白1(HWP1)和白念珠菌芽管抗体(CGTA)等检测发现其敏感性和特异性与其他诊断标志物是一致的，即使在免疫高度受损的患者如干细胞移植和肝移植受体也存在念珠菌有关抗体。在诊断系统念珠菌病的应用上，检测几种不同抗体的组合优于单一抗体。本文就目前念珠菌抗体检测在早期诊断IC 的研究作一综述，为进一步完善IC 的抗体检测策略作一探讨。
1 白念珠菌芽管抗体(抗CAGT)
       念珠菌可以酵母或菌丝形式生长，而且在对白念珠菌毒力的研究中，其菌丝相被认为是其致病的主要形式，菌丝相的致病力显著强于酵母相。在正常情况下，念珠菌主要以芽生酵母的形态与机体处于共生状态，但也存在酵母相-芽管-菌丝相的形态转换。当酵母相转向菌丝相时，便有少量的芽管-菌丝相特异性可溶性抗原释放入血，可刺激机体产生相应的抗体IgM。当发生IC 时，可出现大量菌丝相特异性呵溶性抗原释放入血，刺激机体产生特异性IgM或IgG升高。因此，既可从血液标本中检测到芽管或菌丝相的特异性抗原，也可检测其相应的抗体，来确诊全身性念珠菌感染。Moragues等应用表达于白念珠菌芽管上的两种特异抗原(180 kDa和>200 kDa)，建立间接免疫荧光检测方法[4]，对可疑IC 的免疫受损和免疫正常患者血清预处理后(吸收血清中抗孢子细胞壁表面的抗体)检测其中是否存在特异性白念珠菌芽管抗体IgG，以≥1：160为临界值，显示其敏感性79%～89%，特异性91%~100%。抗CAGT对患者的IC 诊断早于临床和放射学诊断。若与BG结合一起诊断IC，可将特异性和阳性预测值提高到100%[5]。
2 HWP1抗体
       HWP1(菌丝壁蛋白1)是已鉴定的存在于念珠菌芽管和菌丝壁上的特异性蛋白之一。它是一种酸性蛋白(PI 3.37)，分子量大小为61122 Da。抗原决定簇位于蛋白的N端，其他部分含有丰富的羟基氨基酸，终端为一串典型的翻译后糖基磷酯酰纤维醇(6 PI)修饰的特异的15个氨基酸序列。它富含丝氨酸/苏氨酸，是葡聚糖的连接蛋白，是哺乳动物转谷氨酰胺酶的底物，它的生理功能是细胞外的配体结合决定簇[6]。HWP1在芽管-菌丝相是高度诱导的，而在酵母相时不存在。Lain等根据白念珠菌HWP1的N 端抗原表位设计引物，克隆表达出大小34～36 kDa的蛋白，以它为抗原建立免疫斑点法和ELISA试验，对36例血液病或ICU 的血培养念珠菌阳性的IC患者和45例对照病例(具有真菌病危险因素而没有发生IC 的临床微生物学证据患者)进行血清相应抗体检测，结果与间接免疫荧光法检测CAGT抗体进行比较。免疫斑点法的敏感性27.8%、特异性95.6%、阳性预测值83.3%和阴性预测值62.3%；ELISA方法临界值为：无IC 证据患者血清相对吸光度的均值的3倍，其敏感性88.9%、特异性82.6%、阳性预测值80%和阴性预测值90.2%。用ELISA检测，可观察IC 患者血清HWP1N 端抗体效价水平随着抗真菌药物应用而降低，该动态变化与检测CAGT抗体非常一致。由于白念珠菌HWP1基因编码的前85个氨基酸残基的区域与其他念珠菌(如都柏林念珠菌、光滑念珠菌、无名念珠菌，解脂念珠菌)的HWP氨基酸序列一致，因此，不同念珠菌的HWP1间存在相同的表位，所以该重组HWP1蛋白抗原也可使部分其他非白念珠菌引起的IC 检测阳性。因此，ELISA检测HWP1N端抗体可用于诊断IC，与检测CAGT抗体结果相一致，并且该方法不需要预处理血清吸收抗孢子细胞壁表面的抗体[7]。
       但该方法不适于检测口腔和阴道念珠菌病患者。Naglik等对念珠菌定植携带者和念珠菌病患者的念珠菌HWPl基因体内表达和宿主抗体反应检测发现：念珠菌培养阳性的有、无症状患者标本中HWP1mRNA均存在；无症状且其口腔或阴道标本培养阴性对照，其标本HWP1mRNA未检测到。这暗示着菌丝和可能的假菌丝在黏膜携带者和发病人群中都存在。但在培养阴性的健康对照，口腔念珠菌病和无症状黏膜感染者，局部唾液和血清均存在着HWPI抗体，唾液IgA和血清IgG水平在三者间无差异[8]。
3 烯醇化酶抗体
       烯醇化酶属胞浆内酶，有440个氨基酸组成，分子量大约48 kDa，是生物体内糖酵解途径中关键胞内酶。在念珠菌体内大量产生，可存在液体培养上清中。在IC患者血液中循环，检测抗原可作为IC 的标志物。同时，具有免疫原性，可刺激机体产生细胞和体液免疫。因此，抗烯醇化酶抗体具有诊断价值，还有免疫保护作用[9]。另外，它还是过敏原。Lain等建立ELISA方法检测IC患者(包括47免疫受损患者和51例免疫正常患者)的血清烯醇化酶抗体。该方法敏感性81.0%、特异性83.9%、阳性预测值79.1%、阴性预测值85.5%[10]。
4 两个或多个白念珠菌抗原IgG反应作为IC早期诊断的准确标志物
       Pitarch应用免疫印迹分析57例系统念珠菌病患者显示：患者高水平葡聚糖(1，3)-β-葡萄糖苷酶(Bg12P)抗体和细胞壁磷酸甘油酯激酶抗体阳性是独立的预测系统念珠菌病的标志物[8]。
       Clancy等选择了具有不同功能和细胞定位的12种蛋白作为抗体检测的靶标。这些蛋白分为四组：细胞壁蛋白(Bg12和MUCI)，细胞浆糖分解酶(EN01，FBA1，GAP1和PGK1)，定位细胞壁的细胞内蛋白(NOT5和MET6)，非定位细胞壁的细胞内蛋白(CAR1，RBT4，SET1和IPF9162)。应用编码蛋白的全部或部分基因序列设计引物通过PCR扩增，由于MET6、MUC1和PGK1有两个扩增片段，导致有15个DNA序列，因而诱导产生15种重组抗原。应用15种重组抗原建立ELISA方法，检测60例由不同种念珠菌引起的系统念珠菌病患者和24例对照的血清抗体反应，结果显示：系统念珠菌病患者的15种抗原的平均log2IgG效价明显高于对照。然而，只有7种抗原(ENO1、PGKI-1、NOT5、SET1、RBT4、IPF9162、CAR1)的平均log2IgM高于对照。另外，IgG效价在85%~98.3%的系统念珠菌病患者中可检测到，IgM效价仅在10%～68.3%的患者中可检测到。抗MET6-1、NOT5、RBT4、ENO1的平均IgG效价在白念珠菌患者高于非白念珠菌患者。在系统念珠菌病患者中，只有PGKI-2的IgG效价在免疫正常患者高，其他14种抗原的IgG效价在免疫受损宿主和免疫正常宿主间无差异，IgG效价在烧伤、侵入性操作等患者中无差异。应用15种抗原的IgG描述分析建立的一种数学预测模型鉴别诊断系统念珠菌病，误差率为3.7%，敏感率为96.6%，特异性为95.6%。而且，应用其中四种抗原简化的预测模型预测系统念珠菌病的公式为：分值=(0.10×SET1+0.07×ENO1-0.04×MUCI-2-0.02 x PGKI-2-0.12)，这里SET1、ENO1、MUCI-2、PGKI-2为单个患者特异性抗体的log2IgG值，得分>0.5为系统念珠菌病阳性)分析，产生了与15种抗原整个组合一样准确的诊断效果。应用该简化的模型，对其他16例血培养2 d内阳性的系统念珠菌病患者和16例对照血清检测结果分析，只有2例对照错误鉴别为系统念珠菌病，敏感性100%特异性87.5%。对8例IC 患者急性期和恢复期血清检测，四种重组抗原(SET1，EN01，PGKI-2，MUCI-2)的平均log2IgG值，恢复期血清高于急性期的。而且，IgG效价至少四倍增高的有SET1占100%，ENO1 87.5%，MUCI-2 62.5%，PGKI-2 75%。该方法不适用于新生儿患者的Ic诊断，8例新生儿血清抗重组抗原的IgM和lgG效价与背景对照难以区分外[11]。
5 展望
       血培养是诊断IC 的金标准，但培养阳性往往出现在感染的相对后期[12]。临床微生物实验室最常做的念珠菌痰培养，对肺念珠菌病诊断的敏感性为85%、特异性60%、阳性预测值42%、阴性预测值93%[13]。而且，念珠菌培养鉴定耗时长，远远不能满足临床需要。
       近年来的研究显示：念珠菌在黏膜定植时可能已有部分细胞肇抗原暴露于宿主免疫系统，当发生IC 时，机体产生免疫记忆反应，表现出相对早期IgG的反应，并优于IgM。而IgM升高的血清抗体其抗原是念珠菌胞浆内抗原，在定植共生状态下，可能极少暴露于机体体液免疫系统[11]。其次，当发生IC 时，免疫受损患者表现出与免疫正常患者类似的血清学反应，IgG早期升高，说明血清抗体检测同样也适用于免疫受损患者早期诊断念珠菌病[7，8，10]。第三、不同念珠菌种间的非保守蛋白存在共同的表位，因此，克隆来源于白念珠菌的重组抗原可与非白念珠菌相应抗体发生交叉反应，所以，该方法可同时诊断白念珠菌和非白念珠菌的侵袭性感染[10]。并且随着抗真菌药物治疗，IgG水平下降，所以，也不失为一种疗效观察的方法。
       对IC 的诊断，多个抗体指标优于单一抗体指标，这不仅与念珠菌本身抗原成分复杂有关，也与不同宿主免疫应答存在差异有关[14]。因此，筛选最佳靶抗原组合，优化血清IgG抗体检测方法，应是今后研发侵袭性念珠菌病早期诊断的方向[15]。不远的将来，血清抗体检测将成为临床IC 早期快速诊断的常规方法，以正确指导临床合理启动抗真菌治疗，减少治疗的盲目性和滞后性，提高IC 治愈率[16]。
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                                                                                                编辑：范伟伟