淋球菌实验室诊断进展

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                                                                                        广西乐业县疾病预防控制中心     黄永亮 金雄章
       淋球菌是引起淋病的致病菌，有严格的人类寄生性，对人体有较强的适应和侵袭能力，是发展中国家发病率最高之一的性传播疾病[1]，在我国有逐年增长趋势[2，3]。本病诊断主要依赖于实验室检测，传统的涂片法简便、价廉但敏感性低，近年来出现的新型培养基、免疫学方法检测和聚合酶反应技术具有较高的敏感性及特异性。本文将淋球菌实验室诊断进展综述如下：
1 涂片检查
       取脓性分泌物涂片做革兰染色，镜下可见大量多形核白细胞，多个多形核白细胞内可见数量不等的革兰阴性双球菌。淋球菌呈肾形或卵圆形，常成双排列，凹面相对，急性期主要分布于细胞内，少数也可分布在细胞外，慢性期则以细胞外为主。本法对有大量脓性分泌物的单纯性急性淋菌性前尿道，尤其是男性淋菌性尿道炎敏感性可达95%，对慢性淋病患者敏感性较低，女性患者易出现假阳性。细胞外查到革兰性双球菌只可作为诊断线索，卫生部推荐用培养法检查确诊。淋菌性咽炎涂片检查无意义，因为正常咽部存在其它类型的奈瑟菌。
2 荧光抗体染色法
       抗淋球菌抗体标记荧光素后，与淋球菌结合时，在荧光显微镜下见到发特异荧光淋球菌。该试验取患者分泌物或初代分离的培养物制成涂片，干燥后加热固定，将经稀释的淋球菌荧光血清滴加于涂膜上，置37℃湿盒内30分钟，使抗体与淋球菌结合，再用磷酸缓冲液充分洗去未结合之血清，甘油封固剂封片，用荧光显微镜检查。如是阳性标本，则在荧光显徽镜下可见到发蓝色特异荧光的双球菌。本法是直接荧光抗体染色法，标本制成后即可进行染色和观察结果，只有抗原抗体两种因子参加反应所以方法简便、快速，但市售的抗淋球菌荧光抗体也可和脑膜炎球菌和某些其它的奈瑟菌起交叉反应，此外，也有些淋球菌菌株不与所用的抗血清起反应。
3 培养检查
       培养法被认为是诊断淋球菌的“金标准”，但其缺点是费时、操作繁琐。标本取后立即接种于培养基中，初代分离应用5%二氧化碳环境，淋球菌经24~48小时培养后，形成圆形、凸起、湿润、光滑、半透明或灰白色的菌落，边缘呈花货瓣，根据菌落形态、涂片染色做出初步诊断，如氧化酶试验阳性、糖发酵试验分解葡萄糖则可确定诊断。淋球菌培养对症状很轻或无症状的女性和男性患者敏感性均高，因此培养法是目前世界卫生组织推荐的筛查和诊断淋病患者的主要实验室方法。国外常用的培养基有Thayer-Martin培养基、NewYork City培养基、Martin-Lewis培养基等， 国内也已研制成为国产培养基。刘琪等[4]在Thayer-Martin培养基GC基础配方的基础上，加入一定比例的酵母浸出物、可溶性淀粉，用新鲜卵黄代替ISO-vitalex液和血红蛋白， 研制出新型淋球菌培养基，经临床应用，结果与Thayer-Mertin培养基比较。符合率为100%。新型淋球菌培养基特点是淋球菌生长快速，菌落典型，抑制杂菌效果好，选择性强，操作简便、经济。是国产一种较理想的分离淋球菌的培养基。
4 免疫学方法
       4．1 酶联吸附试验：目前应用最广泛的免疫学方法是酶联吸附试验(Enzyme Linked immtmosorbent assay，ELISA)。其原理是根据抗原抗体特异性免疫反应原理设计，将已知的抗原或抗体结合在某种固相载体上，以辣根过氧化酶为指示剂，标记在另一种抗原或抗体上，加入酶作用底物。酶与底物发生反应后，底物显色，根据底物显色的深浅定性或定量地检测样本中的抗体或抗原的量。ELISA抗原、抗体的包被与固定是关键，影响检测的灵敏度和特异性。沈建根等[5]设计了一种新的包被方法，用链霉亲和素替代抗体包被微孔，建立了生物素-链霉素亲和素技术一步法检测淋球菌抗原方法，对36例临床淋球菌标本进行检测，结果显示，特异性100%，敏感性97.2%。金怡等[6]用固相合成肽方法合成2个淋球菌多肽抗原。建立测定淋球菌抗体的酶免疫测定，并对89份正常人血清和47份淋病患者血清进行检测。结果批内测定变异系数为7.1%，批间测定变异系数为10.7%。ELISA法从抗原或抗体的包被到酶联显色，都已经具备了成熟的技术，目前已制成试剂盒，操作简单、快速．试剂稳定、特异性好、灵敏度高，深受基层检测单位欢迎。
       4．2 免疫胶体金技术：根据双抗体夹心法、双抗原夹心法和竞争抑制法免疫反应原理设计，以胶体金作为指示标志，标记在抗原或抗体上，抗原抗体发生免疫反应后显色，根据显色深浅定性检测患者标本中的抗体或抗原。目前市场上淋球菌金标检测卡多以胶体作为指示标记。采用交联抗-淋球菌单克隆抗体与泌尿系统标本中淋球菌菌体抗原结合。形成夹心一步法。肖志明[7]用淋球菌快速检测卡、培养法和涂片革兰染色镜检法同时对100例疑为性病患者进行淋球菌检测，结果淋病快速检测卡灵敏性和特异性均高于培养法。操作简便、反应迅速，尤其适合基层临床检验、性病门诊及家庭卫生保健使用。
5 聚合酶链反应(PCR)
       PCR是1985年建立起来的一种体外DNA扩增试验。其基本原理是酶促DNA合成反应，即在模板DNA、引物和脱氧核糖核酸存在下，在DNA聚合酶的作用下，使DNA链扩增延伸。由于试验的敏感性和特异性高。对标本采集的要求远不如培养那么严格，使它在医学领域得到广泛应用。
       5．1 任意引物PCR：叶顺章等[8]根据基因库所提供的淋球菌染色体随机克隆片段ORF-1基因序列设计了一对引物。能特异地对所有血清型淋球菌扩增出预期的461 bp片段，而对其它细菌无反应。采用PCR和培养法对57份临床标本进行检测，结果如以培养法为金标准，PCR的敏感性为97.1%，特异性为91.3%，对淋球菌悬液作梯度稀释后检测，发现该PCR最高灵敏度是检出30个淋球菌。
       5．2 实时荧光定量PCR(FQ-PCR)：常规PCR检测需要从反应体系中吸取产物做电泳或Southern杂交等实验进行鉴定,转移过程中易污染，造成假阳性，而且耗费时间。1992年Higuchi 提出了实时PCR设想，1996年美国应用生物系统公司(Apphed Biosystems，ABI)研究出FQ-PCR技术，其原理是PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸。两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR仪检测不到荧光信号；PCR扩增时(在延伸阶段)，Taq酶的5'-3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离。从而荧光监测系统可接收到荧光信号。2005年Geraats-Peters 等[9]将淋球菌检测靶片段的透明蛋白(opa)基因作为靶目标，设置了2条荧光探针即M13-opa-Fw(TGT AAA ACG ACG GCC AGT GTT GAA ACA CCG CCC GG)and M13-opa-Rv (CAG GAA ACA GCT ATG ACC CGG TTT GAC CGG TTA AAA AAA GAT)，进行实时PCR检测，并以传统165 rRNA及COBAS扩增系统作为对照，实验结果显示，COBAS出现假阳性或假阴性，opa基因在检测淋球菌中较165 rRNA敏感性高。并且不出现假阳性或假阴性结果。实时PCR检测快速、准确、可靠，但需要昂贵的荧光检测仪和荧光标记探针，一般的实验室不能广泛开展。
       随着基因组学、现代分子生物学理论与技术的发展以及新仪器研发。淋球菌的检测方法将向快速、准确、灵敏、特异的方向发展。特别是PCR、ELISA等现代分子生物学技术的联用及实时PCR的进一步完善，将会出现淋球菌快速、准确、灵敏、特异、大规模的检测诊断，大大提高公共场所从业人员检验检疫和临床诊断的检测质量和效率。
参考文献：
【1】Van Dyck Ejeven M，Pattyn M，et al．Detection of Chlamydia txaehonmalis and neisseria gonorrhoeae by enzymeimmunottssay cultureandthree nucleic acid amplification tests[J]．Clin Mierobiol,2001，39(5)：1751．
【2】龚向东，叶顺章，张君炎，等．1996-2001年我国性病流行病学分析[J]．中华皮肤科杂志，2001，35(3)：178．
【3】徐丽玲，顾伟泯鸣，杨阳，等．1996-2003年上海市某医院泌尿生殖分泌物标本性病检测结果分析[J]．中国艾滋病性病2005，11(2)：121．
【4】刘琪，刘念一，韩力苏，等．新型淋球菌培养基及其鉴定系统的研制及应用[J]．中国公共卫生，2002，18(4)：492．
【5】沈建根，朱永良，董玉娥．生物素链霉亲和素技术一步法检测淋球菌抗原的研究[J]．浙江医科大学学报，2000，29(6)：250．
【6】金怡，俞炳耀，甄子刚，等．多肽抗原检测淋球菌抗体ELISA法的建立及应用[J]．上海第二医科大学学报，2001，21(6)：515．
【7】 肖志明．淋球菌3种常用检测方法的比较[J]．现代临床医学生物工程学杂志，2004，10(2)：159．
【8】叶顺章，王千秋，王荷英，等．PCR检验技术在性病临床标本实验诊断中应用价值的研究[J]．中国皮肤性病学杂志，2002，16(1)：6．
【9】Geraats-Peters CWM，Brouwers M，Schneeberger PM，et M．Specific and sensitive detection of neisseria gononrrhoeae in clinical specimens by real-time PCR[J]．Glin Mierobiol，2005，43(11)：6553
                                                                                                        编辑：范伟伟