白假丝酵母的快速分离鉴定

岳光

       近年来, 随着人类免疫缺陷病毒( HIV) 感染者的增加, 抗癌、放疗、化疗、器官移植的医疗过程中免疫抑制剂的广泛应用和抗生素的大量使用, 医疗导管等高新技术的不断开展导致念球病呈显著增长趋势, 已成为艾滋病( ADIS) 等免疫功能低下者最常见的并发症和主要死亡原因, 并已构成医院内感染的主要矛盾, 因而引起广泛关注. 国内外学者在白假丝酵母致病性方面已作了大量的工作 . 随着这方面工作的不断进展, 快速分离鉴定出白假丝酵母对于临床和研究具有重要意义.白假丝酵母又称白色念珠菌, 半知菌亚门, 芽孢杆菌, 隐球酵母科 , 有完整的核和细胞壁. 是人和动物的常住型寄生菌, 是一种条件致病菌 .

1 分离鉴定依据
       白假丝酵母的分离鉴定发展史, 是一个从形态学, 特殊生理生化反应到免疫学和分子生物学的发展过程.
1.1 根据形态学进行鉴定
       这是最原始也是最基础的方法, 主要采用微生物纯培养技术, 通过培养, 分离成单一菌落, 从其形态, 生理性状和生态环境上鉴定白假丝酵母.
       1.1.1 直接观察菌落的生长情况. 白假丝酵母在Pagano Levin 培养基( 即TTC 培养基) 上呈现无色或淡红色的干酪样菌落, 有光泽. 在科玛嘉( Chromagar) 念珠菌培养基上白假丝酵母呈翠绿色.
       1.1.2 镜下观察菌落特征. 芽管实验及厚膜孢子实验是分离鉴定白假丝酵母的经典实验: 在伊红- 美蓝培养基上培养后, 白假丝酵母在低倍镜下, 多数菌落为蜘蛛样, 少数为单发辫样.
       1.1.3 利用特殊生长条件. 白假丝酵母较其它真菌耐酸耐碱能力更明显. 因此, 可以利用pH1.55 耐酸实验可靠分离鉴定白假丝酵母 .
1.2 根据特殊生理生化反应进行鉴定
       利用白假丝酵母特有的酶类, 不同代谢产物, 生长因素等, 以一系列生理生化反应鉴定白假丝酵母.
       1.2.1 各种酶试验. 1987 年, Perry 和Miller 用香豆素标记的β-N-乙酰氨基半乳糖苷产生的荧光来检测白假丝酵母分泌的β-半乳糖苷酶, 以荧光存在与否来鉴定白假丝酵母. 1990 年Perry 等通过比色法测定白假丝酵母分泌的两种酶即L-脯氨酸氨基肽酶和β-半乳糖苷酶, 建立了快速比色法. 另外, 白假丝酵母由于其本身分泌的酸性蛋白酶作用于血红蛋白, 所以在专用的白色念珠菌形态分布分型培养基上可形成红褐色色素环, 以进行白假丝酵母的快速分离与鉴定 .
       1.2.2 特殊检查. Goldschmidt 等实验证明, 生长在阿尼林蓝染料培养基上的白假丝酵母能产生一种特异的荧光产物, 所以可用阿尼林蓝培养基分离鉴定白假丝酵母. 同样, 白假丝酵母在新的甲苯胺蓝培养基上生长24 h 的菌落在366 nm 长紫外线照射下会发出荧光, 亦能达到分离鉴定的目的.
1.3 根据免疫学原理进行鉴定
       1.3.1 抗原测定. 一般认为可以选用感染菌的细胞壁和细胞质抗原来检测. 当体内感染了念珠菌后, 经吞噬细胞作用, 膜和质抗原会进入血液循环, 未被清除的可以用酶联免疫吸附实验( ELISA) 和免疫印记等方法检测出来. 也有观点认为可使用菌丝相的特异性抗原, 依据是白假丝酵母的菌丝相为它的致病相, 而假菌丝是由孢子出芽形成芽管再继续延长而成的.
       1.3.2 抗体测定. 抗体检测的特异性和敏感性较差, Kappe 等通过复杂的操作使抗体测定有了综合性的改进, 特异性有了很大的提高.
       1.3.3 抗原抗体联合应用. 尽管前两者检测效果都不好, 但各有一定的优势, 联合应用效果有所提高.Sendid 等研究开发出一种抗原抗体联合测定的方法.
1.4 根据分子生物学技术进行鉴定
       1.4.1 基因探针. 应用DNA 探针从基因水平鉴定念珠菌是一种快速、简便、特异的方法. 近年来已逐渐得到人们的重视. 制备DNA 探针主要有3 种方法: 1) 用染色体或克隆的基因组DNA 酶切片段作探针; 2) 用PCR- DNA 产物作探针; 3) 合成寡核苷酸探针. 即使用一小段带有标记( 核素或生物素) 的, 能识别特异碱基序列的单链DNA 分子通过杂交后特异的探针与相应的靶序列配对结合而达到快速准确识别的目的. 用于鉴定白假丝酵母的特异性片段有许多, 例如, 肌动蛋白基因片段, LEU 2 和URA3 基因等等.
       1.4.2 PCR 技术. PCR( Polymerase Chain React ion) 指多聚酶链式反应又称基因体外扩增特定序列方法. PCR 技术是一种快速的DNA 特定片断体外合成扩增技术. 通过体外扩增, 短时间就能获得高拷贝的特异DNA 片段. 然后用特异探针进行杂交, 和特异引物进行PCR 扩增鉴定. 或用限制性内切酶切后进行酶切电泳图谱分析, 从而鉴定白假丝酵母.
       1.4.3 核酸酶切电泳图谱分析技术. 真菌DNA 经过核酸内切酶切后电泳, 它是检测基因间较小差异的敏感手段, 该技术在白假丝酵母检测中有多方面的应用.
       1.4.4 基因芯片技术. 它是20 世纪90 年代兴起的一项前沿生物技术, 工作原理与核酸杂交方法一致.应用已知核酸序列作为探针, 与互补的核苷酸序列杂交, 通过随后的信号检测进行定性定量分析, 能在同一时间内平行分析大量的基因, 进行大信息量筛选与检测分析 .
       1.4.5 基因组核酸电泳核型分析技术. 将DNA 提取物直接电泳, 进行电泳核型分析. 电泳核型是基因组染色体数目和大小在DNA 水平的反映, 可代表酵母菌基因型的基本特征. 各菌种间电泳核型差异较大, 说明其遗传背景存在较大异质性, 这正与这些菌种表型特征有显著区别相符. 这些信息为进一步深入研究其致病因子的编码基因, 分离特异片段用于分子诊断及耐药的分子机制打下基础. 此技术根据基因组大小及核酸含量的多少对真菌进行克隆识别, 念珠菌为酵母样真菌, 含4~ 10 条单倍染色体, 其电泳核型容易比较 .

2 不同分离鉴定手段的评价
       2.1 形态学. 利用形态学技术快速、简便、经济, 但大多数方法存在某些局限性. 芽管和厚膜孢子法需预先分离纯培养获得单个菌落才能进行试验, 不够快速, 且特异性不强. 酸性液基法可直接检测, 也可分离鉴定, 但需镜检酵母细胞且无法直接观察到菌落.
       2.2 生理生化实验技术. 特殊的生理生化实验常可有效地鉴定一些真菌, 但由于其代谢产物表型特征等往往具有相似性, 存在着假阳性, 所以往往两者兼用, 提高分离鉴定的正确率. 其中, 平板色素环法也占一些优势, 可通过肉眼直接观察作出判断以达到培养、分离的目的.
       2.3 免疫学技术. 利用免疫原理对白假丝酵母的抗原、抗体进行检验是一种校好的方法, 但是存在着敏感性、特异性较低的问题.
       2.4 分子生物学技术. 这是目前鉴定的最特异, 最敏感的新技术. 从基因遗传的角度划分, 从分子水平探讨其内在联系, 其结果更为可靠. 其中几种方法还可互为补充, 使白假丝酵母的分离鉴定迈上新台阶.

3 结 语
       综上所述, 传统的分离鉴定方法简单, 易掌握, 较为有效, 所以不应该被忽略. 虽然目前利用的手段各有利弊, 但由于对染色体DNA 的分析更能客观地研究也日益受重视. 尤其是近年来发展的基因探针, PCR 技术, 基因芯片技术等能使检测更为可靠, 简单易行. 显然今后的着眼点将放在特异、敏感、快速、价廉上, 所以面对各种方法, 还应根据具体实验目的和条件来加以选择.
                                                                                                    编辑：范伟伟