接种用培养皿大小对微生物标本培养结果的影响

夜游神

      【摘要】目的观察标本接种用培养皿大小对培养结果的影响。方法应用直径7 cm、直径9 cm 的血培养皿、加万古霉素的巧克力和麦康凯培养皿对比接种痰、分泌物等标本，观察培养结果，计算培养阳性率。结果接种标本344例，直径7 cm 培养皿上培养出临床有意义细菌141株，培养阳性率为41．0％；直径9 cm 培养皿上培养出有意义细菌169株，培养阳性率为49．1％，直径9 cm板比直径7 cm 板检出阳性率提高8．1％，差异显著(X2 =4．6，0．01<P<0．05)。结论直径9 cm 培养皿比直径7cm 培养皿检出临床有意义细菌阳性率高，建议临床微生物室接种标本时采用直径9 crn 的培养皿。
      【关键词】细菌；接种；标本；培养技术

       我国对接种标本用培养皿大小并无制定标准。因此，各实验室使用的培养皿大小不等。接种标本用培养皿大小是否影响培养结果，本组以直径7 cm 和9 cm 的培养皿对比接种319例标本作一阐述。

资料与方法
       1．资料  标本319例来自本院门诊及住院患者，15例来自卫生部临床检验中心室间质控，10例来自江苏省临床检验中心室间质控。其中痰183例，烧伤创面分泌物54例，阴道分泌物39例，前列腺液30例，眼部分泌物14例，咽拭子24例。培养皿：材质为一次性硬质透明塑料。培养基：血培养皿为哥伦比亚血琼脂基础121℃ 1．05 kg／cm2，高压15 min后加入新鲜脱纤维绵羊血；巧克力培养皿为哥伦比亚血琼脂基础121℃高压15 min，冷却到85℃加入新鲜脱纤维绵羊血，60℃左右加入3ug／mL的万古霉素；麦康凯培养皿使用浙江天和有限公司产品。细菌鉴定：法国梅里埃VITEK—32联合手工鉴定。
       2．方法  收集新鲜标本(室间质控标本视同临床标本)，根据《全国临床检验操作规程》及室间质控要求及时处理标本，接种时分成直径7 cm 培养皿组和直径9 cm 培养皿组，接种量相同，分三区划线，置生物培养箱和5％CO2培养箱36．5℃培养18～24 h，必要时培养48 h，观察培养皿上菌落情况，选取可能病原菌，如肺炎链球菌、G- 杆菌等。
       3．统计学处理  采用 X2 检验。

结果
       接种标本344例，直径7 cm 培养皿培养临床有意义细菌141株，培养阳性率为41．0％；直径9 cm 培养皿培养临床有意义细菌169株，培养阳性率为49．1％，两皿相差28株，增加8．1％(X2 =4．6，0．01<P<0．05)。其中肺炎链球菌7株，流感嗜血杆菌6株，草绿色链球菌4株，鲍曼不动杆菌2株，肺炎克雷伯菌2株，铜绿假单胞菌2株，无乳链球菌、阴道嘉德纳菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、近平滑假丝酵母菌各1株。

讨论
       含营养基的培养皿是致病性细菌和真菌生长繁殖的场所，为它们提供优良、舒宜的生长环境，是发现和了解它们的重要工具，痰、分泌物等标本易受定植在呼吸道及皮肤等部位的正常菌群的污染，进行细菌学检验时，通常可从送检的标本中分离出多种细菌，确定哪一种分离细菌是引起感染的病原菌，这对临床诊断与治疗感染性疾病至关重要，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等细菌在临床上一般被视为病原菌，在实际工作中由于细菌生长速度不一致，这些营养要求高或生长较慢的细菌可能被生长速度快的细菌，包括正常菌群菌落所掩盖。有些病原菌数目较少，体检中正常共生菌过度滋生，因而压抑或隐蔽重要病原菌的分离。如何更好地将正常菌群与病原菌分离是微生物工作者不断探索的课题，增大培养皿的尺寸，改善细菌生长的空间，是否对培养的结果构成影响?本组对比接种临床标本344例，直径7 cm 培养皿培养出有意义细菌141株，直径9 cm 培养皿培养出有意义细菌169株，直径9 cm 培养皿比直径7 cm 培养皿分离有临床意义细菌多28株，差异有统计学意义(X2 =4．6，0．01<P<0．05)。直径7 cm i培养皿上未培养出的细菌主要是营养要求较高的细菌，少数一些是快生长的细菌，这些高营养需求细菌在生长过程中需要的营养物质有可能被快速生长的常居菌消耗，另外快生长的细菌产生的代谢产物在一定程度上有可能抑制甚至杀死高营养需求的慢生长菌，这时较大的菌落间隙将能更好地起到保护慢生长菌的作用。由于抗生素的使用，标本中可能存在药物残留，使用大的培养皿对药物亦能起到较好的稀释作用，这也是一些G- 杆菌在直径7 cm 培养皿上被抑制而在直径9 cm 培养皿上有菌落生长的重要原因，虽然很少的G- 杆菌有污染的可能，但与临床医师良好的沟通、标本的直接革兰染色视为培养的补充，可对培养结果进行核对，较好地验证培养结果的可靠性，进一步确定是病原菌还是污染菌。
       直径7 cm 的培养皿对于直径9 cm 培养皿，其手握操控性好，培养基用量也少，被多数临床实验室应用于常规接种、分离标本使用，但对于杂菌数量多的标本，直径7 cm 的培养皿提供胺与万古霉素对葡萄球菌特别对MRSA、MRNOC 的抗菌活性，均有很强的抗菌活性，本研究中未发现耐利奈唑胺与万古霉素的葡萄球菌。葡萄球菌对甲氧西林的耐药率在不断上升。从本组研究的资料显示，葡萄球菌耐甲氧西林的耐药率高达89％，要比相关文献高，这与地区的差别及用药有关。MRS的增加使泛耐药菌株明显增加，这已成为当今困扰临床治疗的棘手问题。
       利福平和四环素对葡萄球菌有较高的抗菌活性，耐药率较低，分别为28．2％、43．9％。这可能是由于临床上治疗葡萄球菌感染时使用利福平和四环素抗菌药物较少之故，同时由于利福平治疗葡萄球菌感染时很容界产生耐药，因此单独采用利福平治疗葡萄球菌是不妥的。
       MLS(红霉素、克林霉素、链阻霉素)类抗菌药物主要被广泛用于治疗葡萄球菌感染，皮肤和软组织的葡萄球菌感染常常选用克林霉素。但临床上克林霉素治疗失败的原因在于诱导型erm 机制所致。本组对72株红霉素耐药克林霉素敏感的葡萄球菌进行D-试验，结果有41株D-试验阳性，阳性率为56．9％。D-试验阳性葡萄球菌为核糖体诱导型耐药。因此在药物敏感试验中，如红霉素耐药克林霉素敏感时，不能简单报告为克林霉素敏感，而需加做D-试验后作最后判断。
       利奈唑胺(Linezolid)为新一代抗阳性球菌药物，属于恶性烷酮类，其为细菌合成抑制药，作用于50S核糖体亚单位终止蛋白合成，主要用于翻译起始阶段，干扰包含mRNA、50S核糖体、起始因子和N-甲酰甲硫氨酸转移核糖核酸(fMet-RNA)等复合物形成，从而抑制了细菌蛋白质的合成。由于利奈唑胺的使用靶部位和方式独特，因此不论具有天然或获得性耐药特征的阳性细菌都不易与其他抑制蛋白合成的抗菌药物产生交叉耐药，在体外也不易诱导产生耐药性。该药为近年上市的新的抗革兰阳性球菌药物，其对MRS的抗菌活性报道很少，本实验结果显示利奈唑胺对所有葡萄球菌都有很强的抗菌活性，它是目前治疗严重MRS最佳抗菌药物之一。自1996年在日本发现第一株耐万古霉素的金黄色葡萄球菌以来，法国、英国、美国等地也陆续发现耐万古霉素的金黄色葡萄球菌且有蔓延的趋势。这种潜在威胁应引起临床的高度重视，据有关资料分析显示，利奈唑胺对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、A群链球菌及耐万古霉素的肠球菌等均有良好活性，是目前治疗耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)感染惟一可选择的药物。
       利奈唑胺虽是目前治疗MRSA、MRCNS及VRE 的最佳抗菌药物，但临床应合理使用利奈唑胺，以防止耐药菌的形成。
                                                                                                  编辑：范伟伟