嗜肺军团菌致病性的研究进展

岳光

嗜肺军团菌( Legionella pneumophila，Lp) 是引起军团菌病的病原菌，它是一种革兰阴性杆菌，嗜热怕冷，属兼性胞内寄生菌。嗜肺军团菌广泛存在于水、土壤中，特别是与日常生活密切相关的自来水、空调、冷却塔、淋浴器等供水系统中。国外有“有水即有军团菌”之说。无论是冷、暖气产生含有军团菌的气溶胶被人体吸入后可引起以肺部为主的全身性感染。嗜肺军团菌共有15 个血清型，其中血清1型在人军团菌病中最常见，约占80%。随着人们生活水平不断提高，嗜肺军团菌危害性及其控制的重要性日益受到广泛关注，人们需要认识嗜肺军团菌对宿主的致病机理。本文就嗜肺军团菌的致病性及相关致病物质进行综述。
1 嗜肺军团菌的细胞内增殖
      嗜肺军团菌是兼性胞内寄生菌，可以在原生动物及真核生物的巨噬细胞内繁殖，并逃避吞噬溶酶体的杀菌作用，建立自己独特的繁殖方式。嗜肺军团菌进入人体肺泡，被肺泡巨噬细胞吞噬，形成特殊的含嗜肺军团菌囊泡，嗜肺军团菌在肺泡巨噬细胞内繁殖，引起急性重症性肺炎、军团菌病。
      1．1 入胞方式 嗜肺军团菌进入人体肺泡，引发补体C3的降解，嗜肺军团菌的外膜蛋白使C3b 固定在其表面，利用C3b 与吞噬细胞的补体受体CR( Complement receptor) ，促进吞噬细胞对嗜肺军团菌的获取。嗜肺军团菌通过胞质内陷的方式进入宿主细胞，这个过程需要宿主细胞肌动蛋白骨架的参与，在胞浆中形成含军团菌的吞噬体囊泡。嗜肺军团菌在巨噬细胞中通过二分裂繁殖，大量繁殖后会把细胞内营养物质耗尽，此时就会胀破吞噬泡，导致宿主细胞死亡。热灭活和福尔马林灭活后的嗜肺军团菌通过正常吞噬途径进入吞噬细胞，可形成吞噬溶酶体，最终嗜肺军团菌被降解。致病性的嗜肺军团菌进入宿主细胞后形成含嗜肺军团菌的吞噬体囊泡不与溶酶体融合，不会被降解。
      1．2 含嗜肺军团菌囊泡( L．pneumophila －Containing Vacuole，LCV) 的形成 正常情况下，吞噬细胞吞噬细菌，形成吞噬体，吞噬体成熟为吞噬溶酶体。这个过程涉及到细胞内诸多细胞器，并且可以引起吞噬泡的酸化和大多数细菌的
降解。整个吞噬过程因其获得早期吞噬泡特殊标记，这些标记包括分子较小的鸟苷酸三磷酸酶Rab5 和早期吞噬体抗原EEA1( early endosome antigen 1) 。吞噬体表达Rab5、EEA1 后继续募集Rab7 和其他胞内体蛋白，如溶酶体相关膜表面糖蛋白( Lysosome －associated membrane glycoprotein，LAMPs) 、组织蛋白酶D 及其他酸性水解酶类的聚集，最终会导致吞噬溶酶体的形成。嗜肺军团菌以内吞的方式进入人体肺泡吞噬细胞，形成LCV。LCV 独特的生成方式包括吞噬体之间的融合及吞噬体与细胞内小囊泡和宿主细胞分泌的膜蛋白的融合。对LCV 最初的检测表明，其表面带有宿主细胞核糖体的成分最终不会被酸化。通过对LCV表面BiP 蛋白检测及电镜下对膜厚度的观察表明，嗜肺军团菌被吞噬5min 内LCV 即开始募集内质网囊泡。囊泡形成15min 后，囊泡膜开始变薄，厚度小于宿主细胞膜。LCV 获得内质网和高尔基体间循环的囊泡蛋白，LCV 只补充Rab1，而不是Rab2 或Rab6 ( Rab1、Rab2 和Rab6 是小GTP 酶) ，抑制Rab1 的活性会阻碍细胞内嗜肺军团菌的繁殖。囊泡形成1 ～ 2h，内质网蛋白开始与LCV 连接，4 ～ 6h的时候，LCV 的膜已经融合入粗面内质网，被吞噬后4 ～ 6h的嗜肺军团菌，开始在囊泡里大量繁殖。细菌的繁殖需要大量氨基酸，氨基酸的转运和自噬作用对于嗜肺军团菌在胞内的繁殖很重要。在LCV 形成18 ～ 24h 后，吞噬标记蛋白LAMP －1、组织蛋白酶D、Rab5 等会逐渐消失。更重要的是，在LCV 形成过程中有较多的Rab7 参与，Rab7 作为一种分子较小的鸟苷酸三磷酸酶在囊泡形成的起始中起着重要调节作用。所以，尽管LCV 的形成和分解不是按照经典的吞噬途径，但在分泌和吞噬过程中仍然离不开囊泡间的相互作用。
      1．3 胞内生长周期 嗜肺军团菌在宿主细胞有独特的生长周期，即对数生长期和稳定期。嗜肺军团菌动物模型和嗜肺军团病患者的组织样本显示，在嗜肺军团菌对数生长期，细菌在LCV 内大量繁殖，嗜肺军团菌不产生鞭毛等毒力因子，而稳定期产生毒力因子明显增加，也比较强，释放孔蛋白，在LCV 膜和宿主细胞膜上出现大量的小孔，释放出大量的嗜肺军团菌，感染新的宿主细胞，稳定期的传播能力明显增强。Tsuyoshi Hayashi 等人用蛋白质组学、双向差异荧光凝胶方法分析嗜肺军团菌对数生长期和稳定期的毒性， 64 种蛋白在稳定期时比较高，如: 糖酵解有关的酶、酮体、3 －羟基丁酸酯，这表明当氨基酸缺少时，嗜肺军团菌可利用糖和脂质作为能源。与侵袭有关的蛋白在稳定期表达较高，增加了细胞毒性、抗渗透、运动以及逃避吞噬－溶酶体融合的能力，增强感染宿主细胞的能力。
2 致病物质
      近年来，对嗜肺军团菌致病物质的研究已取得了一些进展，如内毒素、鞭毛、Mip 蛋白的pplase 活性、蛋白水解酶和磷酸酶。这些物质可抑制吞噬体与溶酶体的融合，使嗜肺军团菌在吞噬细胞内生长繁殖而导致宿主细胞死亡。
      2．1 内毒素 革兰阴性细菌释放的内毒素在高等生物体内产生病理效应，体现其毒力作用。内毒素大量产生时会引起发热、白细胞减少、呼吸急促、低血压、DIC，并最终导致不可逆性休克。感染性休克综合征有大约20% ～50% 的致死率。嗜肺军团菌的内毒素除了有上述作用外，还可以通过脂多糖维持气溶胶中细菌的浓度，引起促炎作用及肺部感染，能使嗜肺军团菌附着在宿主细胞上，影响吞噬体磷脂双层结构，抑制吞噬体与溶酶体融合。嗜肺军团菌的内毒素能激活补体系统，促进嗜肺军团菌进入单核巨噬细胞内。
      2．2 鞭毛 嗜肺军团菌有一个单极鞭毛，单极鞭毛蛋白由flaA 基因编码。当生长温度高于37℃时， flaA 基因表达降低，稳定期flaA 基因的表达增加，氨基酸缺乏时flaA 基因的表达增加。嗜肺军团菌的鞭毛能促进细菌进入宿主细胞，增强侵袭能力。鞭毛的完整性决定了嗜肺军团菌在阿米巴内的繁殖和感染巨噬细胞的能力。
      2．3 Mip 蛋白 Mip 蛋白是主要的毒力因子，位于嗜肺军团菌外膜，可促进嗜肺军团菌在体内的传播，影响肺巨噬细胞的有氧氧化及胞浆膜去极化，增强嗜肺军团菌穿过肺上皮细胞和细胞外基质的屏障，抵抗宿主细胞杀灭细菌。Mip 蛋白的C － 端具有PPIase 活性，属于FK506 连接蛋白酶家族，能与巨噬细胞FK506 结合，抑制巨噬细胞的活化，逃避巨噬细胞的吞噬。研究表明，只有一个完整的PPIase 活性位点存在时，嗜肺军团菌Mip 蛋白才能发挥其毒力。PPIase 发挥作用使FK506 抑制巨噬细胞，从而使嗜肺军团菌可以在细胞内存活。嗜肺军团菌被单核细胞系MonoMac6 吞噬6h 后Mip 蛋白活性灭活，而在胞内繁殖24h后又复活。Mip 蛋白可以与巨噬细胞蛋白结合，从而逃避吞噬体的吞噬。Mip 蛋白的失活会影响嗜肺军团菌进入巨噬细胞、原生动物、肺泡上皮等真核细胞。
      2．4 蛋白酶 嗜肺军团菌的培养液中或菌体分裂后会产生具有蛋白裂解活性的物质，分子量为38kDa 的蛋白酶，能裂解胶原、产生色素，引起肺组织损伤。组织损伤蛋白酶使某些血液蛋白酶抑制剂如a －抗胰酶失活，还可直接减弱吞噬细胞和NK 细胞的功能。嗜肺军团菌产生含锌离子金属蛋白酶，这种酶可引起吞噬体的破坏和细胞裂解。
      2．5 磷酸酶 部分酸性磷酸酶会使宿主细胞的磷酸蛋白、磷酸糖、磷酸化氨基酸去磷酸化成为致病物质; 部分酸性磷酸酶会抑制中性粒细胞的O2－作用，从而抑制吞噬细胞的杀菌作用。
      2．6 Ⅱ( LSP) 型分泌系统 Ⅱ型分泌系统有两个阶段，第一阶段通过Sec 或Tat 机制穿过内膜，以蛋白质的信号肽为
基础。第二阶段蛋白质进入Ⅱ型分泌系统，插入内膜的多亚基复合物或外膜的带有中央腔的环形复合物。Ⅱ型分泌系统自身由lspFGHIJK、lspDE、lspC、lspL and lspM 基因编码。lspDE 编码外膜、分泌lspD 和ATP 酶LspE，LspF编码内膜蛋白LspF、lspL 和lspM 编码保守的Ⅱ型分泌系统。lspDE、lspG、lspK 突变会使嗜肺军团菌在阿米巴和巨噬细胞内繁殖减弱。总之，Ⅱ型分泌系统使嗜肺军团菌在哺乳动物肺部的存活和繁殖上起着重要的作用，同时也在军团菌生物膜的建立上起着重要的作用。Ⅱ型分泌系统的酶在宿主细胞内生长不起作用。Ⅱ型分泌系统在较低温度下促进嗜肺军团菌生长。
      嗜肺军团菌的Ⅱ型分泌系统包括至少27 种分泌蛋白，主要有锌金属蛋白酶ProA 或Msp、酸性磷酸酶、多脂肪酶、磷脂酶C 和A、LPLA、RNa 酶、耐酒石酸的盐敏感酸性磷酸酶、内切葡聚糖酶。最新发现一个缺乏酒石酸盐敏感酸性磷酸酶，LipA 酶，LipB 酶，LPLA，磷脂C 的突变株在细胞内的繁殖没有受损。此外，这些单突变株在低温环境下的繁殖没有明显增长或减少。进一步的研究表明，尽管这些蛋白酶不是嗜肺军团菌在体外生长所需，但它们能刺激嗜肺军团菌的持续性感染，在嗜肺军团菌模型鼠中得以证明，它们能刺激小鼠持久性感染，感染的小鼠也发现ChiA的抗体( constructed chitinase) ，ChiA 是一种能促进细胞内感染的酶。蛋白酶还可以抑制PMNs 的氧化活性和趋化性，促进嗜肺军团菌的细胞毒性发挥，降解包括IL －2 在内的许多物质。研究显示，ProA/Msp 和RNa 酶SrnA 是嗜肺军团菌在H．vermiformis 繁殖必需的。这些酶在其他宿主细胞内生长可有可无，这牵涉到LSP 分泌系统对宿主的特殊反应的回应。事实上，并非所有的军团菌菌株都有相同的LSP 分泌系统。例如，T2SS 依赖分泌的内切葡聚糖酶不存在于所有的嗜肺军团菌株。T2SS 是革兰氏阴性菌分泌机制中的保守蛋白，它通过控制和释放毒素、蛋白酶在细菌致病过程中发挥作用。
      2．7 Ⅳ型的分泌系统 Ⅳ型的分泌系统包括ⅣA 和ⅣB型分泌系统。嗜肺军团菌的ⅣA 分泌系统现在命名为Lvh( legionella vir homologues) 。这个分泌系统由11vir 编码( LvhB2，B3，B4，B5，B6，B7，B8 ，B9，B10，B11，D4) 组成，有一个调节G + C 含量的区域。嗜肺军团菌费城、巴黎和Lens 株的Lvh 区域由调节染色体和质粒样元素的区域编码。Lvh 系统在30℃增加嗜肺军团菌对宿主细胞的感染，显示了环境对它的影响。PCR 实验显示，从军团菌病患者体内分离的菌株的Lvh 基因与环境菌株相比较，显示了Lvh 基因和毒力之间存在相关性。
      ⅣB 型分泌系统是Icm/Dot， Icm ( intracellular multiplication gene，细胞内繁殖基因) ; dot ( defective organelle trafficking gene，细胞器转运缺陷基因) 。它由2 个致病区域组成，包括7 个基因( icmV、W、X、dotA、B、C、D) 和18 个icm( T、S、R、Q、P、O、N、M、L、K、E、G、C、D、J、B、F、H) 。Icm/Dot是病原体具有毒力的分泌系统。Icm/Dot 在嗜肺军团菌抗吞噬能力中起到关键的作用，如产生了能逃避溶酶体降解的细胞器，维持嗜肺军团菌吞噬小泡，诱导宿主细胞凋亡和裂解。迄今为止，嗜肺军团菌已有超过140 种Icm/Dot被确定，其中LepAB 能促进嗜肺军团菌在原生动物内的释放，SidJ 能促进粗面内质网蛋白运输到LCV，SdhA 能防止巨噬细胞在感染早期凋亡，AnkB 能促进LCV 内的嗜肺军团菌建立一个良好的复制环境，其余大多数蛋白质的单基因突变只能轻微影响嗜肺军团菌在宿主细胞的生长。
      综上所述，自军团菌被分离后，对嗜肺军团菌致病机制的研究有了很大进展。本文就嗜肺军团菌通过胞内增殖引起致病性，不同致病物质在致病过程中发挥的重要作用进行说。但尚有许多不明之处，还需进一步研究，阐明其发病机制，将有助于对军团菌病的预防及治疗。
                                                                                                                                         本文编辑：范伟伟